ANÁLISE DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS 
FACULDADE DE ENGENHARIA AGRÍCOLA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISES DE MATERIAIS BIOLÓGICOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROF. DR. KIL JIN PARK 
DRA. GRAZIELLA COLATO ANTONIO 
 
 
 
 
 
 
2°semestre/2006 
 2 
1. INTRODUÇÃO 
 
Uma das principais funções dos alimentos é fornecer energia ao organismo. Os 
alimentos são compostos complexos constituídos de carboidratos, proteínas, gorduras, 
vitaminas e sais minerais que pela digestão são divididos para serem aproveitados pelo 
organismo. 
Para se conhecer a composição química de um alimento são realizadas determinações 
analíticas. Essas determinações atuam em vários segmentos dentro de uma indústria, desde a 
caracterização da matéria-prima que irá compor um novo produto, até seu controle de 
qualidade e estocagem. 
A análise de alimentos também é utilizada para análise de alimentos processados 
quando deseja-se verificar a eficiência do processo ou até mesmo a comparação de 
processamento, como por exemplo, diferentes tipos de secagem. Através das análises químicas 
pode-se verificar o que ocorreu com os constituintes dos alimentos processados, isto é, se 
ocorreram perdas de vitaminas e/ou minerais, desnaturação das proteínas, gelatinização de 
amido, etc. 
Além de serem utilizadas para a caracterização de alimentos in natura, principalmente, 
alimentos novos e ainda desconhecidos como as frutas ou vegetais exóticos típicos de regiões 
menos exploradas. 
 No processamento de alimentos é importante conhecer a sua composição e avaliar se as 
condições a matéria-prima estará sendo submetida irá produzir efeitos indesejáveis ou mesmo 
desejáveis ao produto final. 
 Para a realização dessas determinações diversos métodos podem ser empregados. Esses 
métodos foram desenvolvidos, testados e catalogados. Alguns centros de pesquisas brasileiros 
desenvolveram métodos analíticos para determinar essas composições, como o Instituto Adolfo 
Lutz, Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Centro de Estudos de Amidos e Raízes 
Tropicais (CERATI), entre outros. 
 A Association of Official Analytical Chemists (AOAC) é uma associação de cientistas e 
organizações dos setores público e privado, que promove a validação de métodos e medidas de 
qualidade nas ciências analíticas. Essa associação, a muitos anos, vem publicando coletâneas 
de métodos de análise e procedimentos obtidos por estudos sistemáticos inter-laboratoriais de 
vários países. São métodos oficiais válidos em todo o mundo e muito utilizados. Os métodos 
estão catalogados em dois volumes, onde são descritos, para cada tipo de produto (frutas, 
cereais, carnes, pós, etc.), os procedimentos recomendados para o preparo e as determinações 
analíticas subseqüentes. 
A escolha do método de análise deve ser bem avaliada para que a exatidão seja a maior 
possível. Em função do alto custo muitas vezes não é possível utilizar o melhor método de 
análise, portanto, o tipo de análise é limitado em relação ao tipo de equipamento ou até mesmo 
ao tipo de reagente ou pessoal especializado. 
 
2. TIPOS DE ANÁLISES 
 
Caracterizar um alimento envolve analisar a sua constituição química, características 
físicas e sensoriais. 
A determinação da composição centesimal dos alimentos visa determinar 
principalmente os teores de: umidade, cinzas, proteínas, carboidratos, fibras, lipídios, vitaminas 
 3 
e minerais. Outros parâmetros como a atividade de água, cor e textura, também possuem 
grande importância na indústria de alimentos. 
Novas ferramentas de análise têm sido muito empregadas na caracterização, controle de 
processo e controle de qualidade de produtos alimentícios, como a análise da microestrutura 
(microscopia ótica, eletrônica de varredura e de transmissão, confocal, etc.). 
 
 2.1. Análises Químicas e Físico-químicas 
 
A análise de alimentos é aplicada para determinação de um ou vários componentes ou 
elementos químicos que o constituem. Com a evolução e o surgimento de novos instrumentos 
de medida, tem havido uma redução considerável no número de análises necessárias para se 
obter resultados, conclusivamente, além de se observar uma grande melhoria na precisão 
dessas análises. 
 
2.1.1. Determinação de Umidade 
 
2.1.1.1. Definição 
 
A determinação de umidade é uma das medidas mais importantes e utilizadas na análise 
de alimentos. No processo de secagem essa determinação é fundamental. 
A umidade de um alimento está relacionada com sua estabilidade, qualidade e 
composição, e pode afetar as seguintes características do produto: 
 
• Estocagem: alimentos estocados com alta umidade irão deteriorar mais rapidamente que os 
possuem baixa umidade. Por exemplo, grãos com umidade excessiva estão sujeitos a rápida 
deterioração devido ao crescimento de fungos que desenvolvem toxinas como aflatoxina. 
 
• Embalagem: alguns tipos de deterioração podem ocorrer em determinadas embalagens se o 
alimento apresentar uma umidade excessiva. Por exemplo, a velocidade do escurecimento em 
vegetais e frutas desidratadas ou a absorção de oxigênio (oxidação) em ovo em pó podem 
aumentar com o aumento da umidade, em embalagens permeáveis à luz e ao oxigênio. 
 
• Processamento: a quantidade de água é importante no processamento de vários produtos, 
como, por exemplo, a umidade do trigo na fabricação do pão e produtos de padaria. 
 
A umidade é o principal fator para os processos microbiológicos, como o 
desenvolvimento de fungos, leveduras e bactérias, e também para o desenvolvimento de 
insetos. No caso dos produtos perecíveis o frio é normalmente utilizado como inibidor do 
processo microbiológico, enquanto que para os produtos deterioráveis a secagem, para níveis 
de umidade até 12-13%, é o processo mais simples e eficaz. O conhecimento do teor de 
umidade das matérias primas é de fundamental importância na conservação e armazenamento, 
na manutenção da sua qualidade e no processo de comercialização. 
 
 4 
2.1.1.2. Métodos para a determinação de umidade 
 
Existem muitos métodos para determinar a umidade em alimentos e a escolha do 
método vai depender: da forma a qual a água está presente na amostra, da natureza da amostra, 
da quantidade relativa de água, da rapidez desejada na determinação e do equipamento 
disponível. 
 A água pode estar presente na amostra sob duas formas: 
• Água livre: é a água que está simplesmente adsorvida no material, é a mais abundante. É 
perdida facilmente às temperaturas em torno da ebulição. 
• Água ligada: é a água da constituição, que faz parte da estrutura do material, ligada a 
proteínas, açúcares e adsorvida na superfície de partículas coloidais, e necessita de níveis 
elevados de temperatura para sua remoção. Dependendo da natureza da amostra, requer 
temperaturas diferentes para a sua remoção, que frequentemente não é total e em alguns casos 
não é eliminada nem a temperaturas que carbonizem parcialmente a amostra. 
 
O aquecimento da amostra pode causar a caramelização ou decomposição dos açúcares, 
perda de voláteis ou ainda a oxidação dos lipídeos. Portanto, é importante uma avaliação 
criteriosa e cuidadosa para a escolha do método mais adequado e conveniente à amostra e 
disponibilidade do laboratório. Por isso, o resultado da medida da umidade deve vir sempre 
acompanhado do método utilizado e das condições empregadas, como tempo e temperatura. 
A conservação da matéria prima, do ponto de vista qualitativo e/ou quantitativo, vai 
depender do tipo de produto com que se está trabalhando e para a determinação da umidade o 
tipo de produto deve ser observado. Os produtos podem ser divididos em: perecível, com alto 
teor de água (como frutas, legumes e vegetais) e deteriorável, com teor de água de 15 a 30% na 
épocade colheita (como os grãos). 
Em geral, a determinação de umidade, que parece um método simples, torna-se 
complicado em função da exatidão e precisão dos resultados. As dificuldades encontradas, 
geralmente, são: a separação incompleta da água do produto; a decomposição do produto com 
formação de água além do original e a perda de substâncias voláteis do alimento que serão 
computadas como peso em água. 
 
 As determinações de umidade são classificadas em métodos diretos e indiretos. 
 
Métodos Diretos 
 
 Nos métodos diretos a água é retirada do produto, geralmente por processo de 
aquecimento, e o teor de umidade é calculado pela diferença de peso das amostras no início e 
no final do processo. 
 Devido a sua maior confiabilidade, os métodos diretos são empregados como padrão 
para a aferição de outros procedimentos. Por exigir um tempo relativamente longo para sua 
execução, às vezes representa uma desvantagem do método, por exemplo, quando se necessita 
de resposta imediata no controle de uma determinada operação. Como métodos diretos têm-se: 
estufa, infravermelho e destilação. 
 5 
a) Método de Estufa 
 
O método de estufa é o método mais utilizado em alimentos e está baseado na remoção 
da água por aquecimento, onde o ar quente é absorvido por uma camada muito fina do alimento 
e é então conduzido para o interior por condução. Como a condutividade térmica dos alimentos 
é geralmente baixa, costuma levar muito tempo (6 – 18 horas a 100 – 102° C, ou até peso 
constante) para o calor atingir as porções mais internas do alimento. A evaporação por um 
tempo determinado pode resultar numa remoção incompleta da água, se ela estiver fortemente 
presa por forças de hidratação, ou se o seu movimento for impedido por baixa difusividade ou 
formação de crosta na superfície. Por outro lado, na evaporação até peso constante, pode 
ocorrer uma superestimação da umidade por perda de substâncias voláteis ou por reações de 
decomposição. 
O aquecimento direto da amostra a 105ºC é o processo mais usual, entretanto, no caso 
de amostras de alimento, que se decompõem ou sofrem transformações a esta temperatura, 
deve-se utilizar estufa à vácuo para seu aquecimento, onde se reduz a pressão atmosférica e se 
mantém a temperatura de 70ºC. 
A pesagem da amostra deve ser feita somente após resfriá-la completamente no 
dessecador, pois a pesagem a quente levaria a um resultado falso. 
 
b) Infravermelho 
 
 Neste método é utilizado um aparelho portátil que permite a obtenção de resultados 
rápidos de porcentagem de umidade, sendo todo o processo controlado por um gerador de 
funções e balança digital. 
A amostra é colocada em um prato de alumínio dentro de uma câmara que protege a 
balança do calor por meio de um colchão de ar, que garante que haja circulação de ar interna 
para que os vapores de água saiam da amostra sem que seja perturbada a leitura da balança. No 
manual do aparelho existem informações sobre as condições recomendadas de análise para 
cada tipo de produto (tempo, temperatura e massa inicial de produto). 
 
c) Método de Destilação 
 
c1) Tolueno 
 
 Quando existem outras substâncias que poderão se volatizar com água no processo de 
aquecimento, a determinação da umidade deve ser feita por processo de destilação com 
líquidos imiscíveis. 
O reagente utilizado é o tolueno. A amostra é moída, pesada (5 a 20g) e colocada em 
um balão contendo tolueno (cerca de 75ml). Este balão é aquecido diretamente e a água da 
amostra vai sendo destilada para o frasco coletor. A quantidade de água contida na amostra é 
dada por leitura direta do volume existente no tubo coletor, onde: volume água = gramas água. 
Este valor é utilizado no cálculo do teor de umidade do produto. 
 
 6 
c2) Brown Duvel 
 
 É semelhante ao método de destilação que utiliza o tolueno, sendo que neste método 
não há necessidade de moer a amostra, e o aquecimento é produzido por um sistema 
termométrico que desliza automaticamente a fonte de aquecimento. É constituído por um 
sistema contendo uma manta aquecedora com balão acoplado a um aparelho de destilação, com 
receptor graduado para coleta da água condensada no processo. 
Para cada tipo de grão, a quantidade ou tamanho da amostra, a temperatura e o tempo, 
variam, devendo-se consultar o manual que acompanha o aparelho. A Tabela 1 apresenta 
alguns exemplos da quantidade de amostra e temperatura para cada tipo de grão. 
 
Tabela 1 – Quantidade de amostra e temperatura utilizadas para diferentes grãos na determinação da 
umidade pelo método de Brown Duvel. 
Produto Amostra (g) Temperatura (°C) 
Milho 100 195 
Arroz 100 200 
Soja 100 173 
Feijão 100 175 
Trigo 100 190 
 
d) Método de Karl-Fisher 
 
 É um processo de determinação de umidade baseado em reações que ocorrem na 
presença de água. 
O reagente Karl Fisher (RKF) é constituído por uma mistura de iodo, dióxido de 
enxofre e piridina em metanol, com este reagente podem ser determinadas pequenas 
quantidades de água. Ocorre uma reação onde o iodo é reduzido pelo dióxido de enxofre, na 
presença da água: 
 
I2 + SO2 + 2 H2O � 2 HI + H2SO4 (reação complexa e não estequiométrica) 
 
O procedimento do método se baseia numa titulação visual ou eletrométrico. O I2 é 
reduzido para o Iodo na presença de água. Quando toda água da amostra for consumida, a 
reação cessa. A titulação direta usualmente fornece a água total, ou seja, água livre mais a água 
de hidratação. O volume de RKF gasto na titulação da amostra é então utilizado nos cálculos 
do teor de umidade. 
Por ser o reagente de Karl Fischer um dessecante poderoso, a amostra e o reagente 
devem ser protegidos contra a umidade atmosférica em todos os procedimentos. 
 Exemplo de aplicação: é aplicado em amostras que não dão bons resultados pelo 
método de secagem a vácuo. Os produtos que são analisados são geralmente produtos com 
baixo teor de umidade como frutas e vegetais desidratados, balas, chocolates, café torrado, 
óleos e gorduras. É também utilizado em produtos ricos em açúcares, como mel, e produtos 
ricos em ambos, açúcares redutores e proteínas, como cereais. O método pode ser aplicado 
 7 
também em produtos de níveis de umidade intermediários como produtos panificados, misturas 
prontas para bolos ricas em gorduras e também em produtos com altos níveis de óleos voláteis. 
 
Métodos Indiretos 
 
 Nestes métodos o teor de umidade é estimado em função das propriedades elétricas do 
produto em uma determinada condição. Os dois princípios empregados são o da resistência 
elétrica e o da medida da constante dielétrica (capacitância). 
 São métodos práticos e rápidos, mas estão sujeitos a erros decorrentes da variação das 
propriedades físicas dos produtos, da temperatura ou da distribuição da umidade no interior do 
mesmo. 
A aferição de equipamentos para a determinação indireta da umidade é feita em relação 
ao método padrão de estufa, admitindo-se variação de 0,5% em relação ao método padrão para 
teores de umidade inferiores a 20-25%. 
O manual de utilização do aparelho deve sempre ser consultado, pois cada amostra 
exige técnica específica. Esse método é mais utilizado para o armazenamento de grãos. 
 
Cálculo do teor de umidade 
 
 Existem duas maneiras de se expressar a umidade contida em um produto em base 
úmida ou base seca, sendo que a umidade em base úmida (Ubú) é mais utilizada em 
designações comerciais, armazenamento, etc. e a umidade em base seca (Ubs) é utilizada em 
trabalhos de pesquisa e equações de secagem. 
 
Umidade em base úmida (Ubú) (%) 
 
100100)( xPP
P
x
tP
PU
sa
aa
bú +
== 
 
onde: Pa = peso da água; Ps = peso da matéria seca (valor constante) e P (t) = peso total. 
 
 
Umidade em base seca (Ubs) (%) 
 
100x
P
PU
s
a
bs = 
 
Mudança de base 
 
Passar deBase Úmida � Base Seca 
 
 100
%100
%% x
U
UU
bú
bú
bs
−
= 
 
 Passar de Base Seca � Base Úmida 
 
 100
%100
%% x
U
UU
bs
bs
bú +
= 
 
2.1.2. Determinação de Lipídios 
 
2.1.2.1. Definição 
 
O termo lipídio é utilizado para gorduras e substâncias gordurosas. Os lipídios são 
definidos como componentes do alimento que são insolúveis em água e solúveis em solventes 
orgânicos, tais como éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio, benzeno e álcoois. 
Estes solventes apolares extraem a fração lipídica neutra que incluem ácidos graxos livres, 
mono, di e triacilgliceróis, e alguns mais polares como fosfolipídios, glicolipídios e 
esfingolipídios. Os esteróis, as ceras, os pigmentos lipossolúveis e as vitaminas, que 
contribuem com energia na dieta, podem ser extraídos apenas parcialmente. 
 Suas propriedades físicas variam muito pouco dentro de um certo limite e são 
consideradas constantes, são divididas em físicas (peso específico, índice de refração e ponto 
de fusão) e químicas (índice de iodo, índice de saponificação, resíduo insaponificável, ácidos 
graxos livres). Estas constantes estão relacionadas à identificação, qualidade e quantidade do 
óleo ou gordura analisada. 
 
2.1.2.2. Métodos para a determinação de lipídeos 
 
A avaliação quantitativa do teor de lipídeos pode ser feita através da extração com 
solvente a frio ou a quente. 
 
Extração com solvente a frio 
 
a) Método de Bligh-Dyer 
 
Esse método utiliza a mistura de três solventes, clorofórmio-metanol-água. A amostra é 
misturada com o metanol e clorofórmio que estão numa proporção que formam uma só fase 
com a amostra. Adiciona-se mais clorofórmio e água promovendo a formação de duas fases 
distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e outra metanol mais água, contendo 
substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada e, após a evaporação 
do clorofórmio, obtém-se a quantidade de gordura por pesagem. 
 
Extração com solvente a quente 
 
A extração com solvente a quente está baseado em três etapas: extração da gordura da 
amostra com solvente; eliminação do solvente por evaporação e a quantificação da gordura por 
pesagem. São utilizados dois tipos de equipamentos: Soxlet, que utiliza o refluxo do solvente e 
o processo é intermitente ou Goldfish, onde o processo de extração é contínuo e mais rápido. 
Geralmente o solvente utilizado é o éter de petróleo e a porcentagem de lipídeo é 
calculada pela equação: 
 9 
)(
)(100%
gamostra
glipídeosxLipídeos = 
 
Extração da gordura ligada a outros compostos 
 
Em produtos como pão e leite, a gordura está ligada a proteína e carboidratos e, 
portanto, deve ser liberada para quantificação. Esta liberação é feita por hidrólise ácida ou 
alcalina. 
 
a) Hidrólise ácida 
 
a1) Processo de Gerber 
 
Utilizado somente para leite e produtos lácteos. A gordura presente no leite está em 
forma de emulsão de óleo e água, cercada de um filme de proteína. Este filme é rompido 
através do tratamento com ácido sulfúrico. Utiliza-se o álcool isoamílico para facilitar a 
separação da gordura e reduzir o efeito de carbonização do ácido sulfúrico sobre ela. Após a 
digestão, a amostra é centrifugada num tubo chamado butirômetro. Existem vários tipos de 
butirômetros com escalas diferentes, para medir diferentes produtos lácteos, como creme de 
leite e queijos, e até para alguns produtos não lácteos, como produtos processados de carne e 
peixe. 
 
a2) Processo de Babcock 
 
Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de leite e ácido 
sulfúricos adicionados, e na adição de água quente em vez álcool isoamílico. Ambos os 
métodos não determinam os fosfolipídios, mas não há problemas com o leite integral que tem 
apenas 1% de fosfolipídios na gordura total O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que 
o de Babcock. 
 
b) Hidrólise alcalina 
 
b1) Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier 
 
A amostra é tratada com hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação 
proteína-gordura, e a gordura separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico. O 
álcool precipita a proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída 
com éter. A extração com éter é muito eficiente em amostras com muito açúcar como, por 
exemplo, leite condensado. 
 
 10 
Caracterização de Óleos e Gorduras 
 
a) Índice de iodo 
 
Método utilizado para determinar o grau de insaturação de um óleo ou gordura e para 
controlar alguns processamentos. Este índice é baseado no fato de que o iodo e outros 
halogênios se adicionam numa dupla ligação da cadeia insaturada dos ácidos graxos. 
 
b) Índice de saponificação 
 
É definido como o número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para 
neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrolise completa de 1 g de amostra. Durante a 
saponificação é formado sabão. 
 
2.1.3. Determinação de Proteína 
 
2.1.3.1. Definição 
 
Proteínas são heteropolímeros formados por unidades menores chamadas aminoácidos. 
Os aminoácidos (a.a.) estão ligados em seqüência formando uma cadeia polipeptídica, esta 
cadeia é a base da proteína e é chamada de estrutura primária. 
 As proteínas são extremamente importantes na nutrição porque fornecem aminoácidos 
essenciais ao organismo. Os aminoácidos são chamados essenciais, pois o organismo não é 
capaz de sintelizá-los, na digestão há a quebra da cadeia de proteínas e os aminoácidos livres 
são absorvidos e usados na síntese de novas proteínas. São aminoácidos essenciais: valina, 
leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, treonina, lisina, arginina, histidina. 
 No processamento de alimentos as proteínas também apresentam propriedades 
importantes como a capacidade de gelificação (gelatina), capacidade de emulsificação (proteína 
da gema do ovo), capacidade de retenção de água (proteína da soja). 
 
2.1.3.2. Métodos para a determinação de proteína 
 
 A determinação da proteína em uma amostra é baseada na determinação de nitrogênio. 
Geralmente é feita pelo processo de digestão Kjeldahl (autor do método: Johan Kjeldahl). 
 Este método determinada o teor de nitrogênio orgânico, ou seja, o nitrogênio 
proveniente de outras fontes além da proteína, tais como: ácidos nucléicos, alcalóides, lipídeos 
e carboidratos nitrogenados. Como estes outros componentes geralmente estão presentes em 
quantidades menores, o método Kjeldahl é um método químico útil na determinação de 
proteína. 
 11 
 No cálculo para se obter a porcentagem de proteína na amostra é utilizado um fator 
empírico de correção “f”. Multiplica-se este fator pelo valor total de N obtido na determinação 
analítica. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de fator “f”. 
 
Tabela 2 – Exemplos de fator “f” para diferentes produtos alimentícios. 
Tipo de amostra Fator f 
Geral N x 6,25 
Gelatina N x 5,55 
Ovos N x 6,68 
Produtos lácteos N x 6,38 
Soja N x 6,00 
Farinha trigo N x 5,70 
Arroz N x 5,95 
Carnes N x 6,25 
 
 Se o resultado for expresso em % de proteína o fator usado deve ser indicado. 
 
 A determinação de nitrogênio é compreendida de 3 etapas: digestão da amostra em 
H2SO4, liberação da amônia por adição de Na0H e titulação da amônia com HCl. O 
procedimento experimental é lento e deve ser cuidadosamente conduzido para se evitar 
acidentes, ou a produção de falsos resultados. 
 
2.1.4. Determinação de Cinzas 
 
2.1.4.1. Definição 
 
A cinza de uma amostra de alimento é o resíduo inorgânico que permanece após a 
queima de matéria orgânica de uma amostra. A cinza é constituida principalmente de grandes 
quantidades de K, Na, Ca e Mg; pequenas quantidades de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e traços de Ar, I, 
F e outros elementos. 
 
2.1.4.2. Método para a determinaçãode cinzas 
 
O método de determinação de cinzas é muito simples e consiste na queima da amostra 
em mufla utilizando temperaturas de 550ºC a 570ºC por tempos pré-determinados. Para cada 
tipo de amostra existem condições recomendadas que devem ser verificadas antes de proceder 
a determinação. 
A cinza obtida não é necessariamente da mesma composição que a matéria mineral 
presente originalmente no alimento, pois pode haver perda por volatilização ou alguma 
interação entre os constituintes da amostra. Os elementos minerais se apresentam na cinza sob 
a forma de óxidos, sulfatos, fosfatos, silicatos e cloretos, dependendo das condições de 
incineração e da composição do alimento. Algumas mudanças podem ocorrer como oxalatos de 
 12 
cálcio podem ser transformados em carbonatos, ou até em óxidos. A composição da cinza vai 
depender da natureza do alimento e do método de determinação utilizado. 
 Amostras com alto teor de umidade devem sofrer secagem antes da incineração, e, 
portanto muitas vezes é vantajoso combinar a determinação direta de umidade e a determinação 
de cinzas. 
 A presença de largas quantidades de cinzas em produtos como açúcar, amido, gelatina, 
frutas ácidas ou pectina é indesejável e, portanto cuidados especiais devem ser tomados durante 
seus processos produtivos. 
 
2.1.5. Determinação de Açúcares 
 
2.1.5.1. Definição 
 
Os carboidratos são os componentes mais abundantes e amplamente distribuídos entre 
os alimentos. Apresentando varias funções como: nutricional (geram energia), adoçante natural 
(glicose, frutose, sacarose, etc.), matéria-prima para produtos fermentados, principal 
ingrediente dos cereais, responsável por propriedades reológicas da maioria dos alimentos de 
origem vegetal (polissacarídeo) e pela reação de escurecimento em muitos alimentos. 
Os açúcares são os carboidratos existentes nos alimentos e são divididos em: 
monossacarídeos (glicose, frutose), dissacarídeos (sacarose, lactose, galactose, maltose), 
polissacarídeos (maltodextrinas, amidos, gomas, pectinas e celuloses). 
Os carboidratos têm pelo menos duas funções orgânicas (C = 0 e C – 0H) que dá a estes 
compostos várias opções de transformação, como: 
 
• Reação de Maillard: açúcares redutores + aminoácidos 
- Reações de escurecimento e formação de voláteis, ex: pão, carne, bolo, etc. 
 
• Degradação de Strecker: 
- Caramelização � degradação de açúcares. O caramelo é um corante largamente 
empregado na indústria de alimentos. 
 
2.1.5.2. Métodos para a determinação de açúcares 
 
Exigências na preparação de amostras: as amostras sólidas devem ser moídas em 
condições que causem a mínima mudança no conteúdo de umidade e que não afetem as 
propriedades e composição do alimento. Os lipídios e clorofila são geralmente removidos por 
extração com éter de petróleo, pois neste solvente os carboidratos são insolúveis. Na 
determinação do conteúdo de carboidratos em alimentos, deve-se obter solução aquosa dos 
açúcares, livres de substâncias interferentes, para posterior identificação e quantificação. Estas 
substâncias interferentes podem ser pigmentos solúveis, substâncias opticamente ativas 
(aminoácidos etc.), constituintes fenólicos, lipídios e proteínas. As substâncias interferentes 
 13 
podem ser separadas por descoloração, tratamento com resina trocadora de íons, ou clarificação 
com vários agentes clarificantes. A função destes clarificantes é de precipitar as substâncias 
que irão interferir na medida física ou química do açúcar. 
 
Os métodos quantitativos utilizados para determinação de açúcares totais e açúcares 
redutores utilizados em alimentos são: 
 
a) Munson-Walker: método gravimétrico baseado na redução de cobre pelos grupos redutores 
dos açúcares. 
 
b) Lane-Eynon: método que utiliza a titulação e também está baseado na redução de cobre 
pelos grupos redutores dos açúcares. 
 
c) Somogyi-Nelson: método que utiliza a titulação e também está baseado na redução do cobre. 
 
Os métodos de redução são empíricos e as condições estabelecidas para cada um deles 
devem ser rigorosamente seguidas. Como reagente utiliza-se: Reagente de Fehling, que é 
composto por uma Solução A (sulfato de cobre cristalino em água) e uma Solução B (tartarato 
de sódio e potássio e hidróxido de sódio) em água. 
Os resultados são expressos em: açúcares redutores, em glicose (%, p/p), açúcares não-
redutores, em sacarose (%, p/p). 
 
2.1.6. Determinação de Fibra Bruta 
 
2.1.6.1. Definição 
 
As fibras alimentares não fornecem nutrientes para o organismo, entretanto são 
elementos essenciais na dieta. As fibras, que formam o esqueleto dos vegetais, consistem de 
celulose de vegetais e outros elementos na alimentação que não conseguimos digerir. As fibras 
são um paradoxo porque não alimentam, mas são essenciais à saúde. 
A fibra bruta é o resíduo orgânico obtido após sucessivas extrações e lavagens com éter, 
ácido sulfúrico diluído, hidróxido de sódio diluído e álcool. 
 
2.1.6.1.1. Importância: 
 
• Medir o valor nutricional de alimentação de animais: digestibilidade da fibra bruta é baixa e 
alimentos com alto teor de fibras brutas, têm baixo valor nutritivo; 
• Análise de Alimentos: detectar adulterações (limites estabelecidos); 
• Qualidade de vegetais: conteúdo de fibra bruta varia com a maturidade. 
 14 
2.1.6.2. Métodos para a determinação de fibras 
 
Os métodos para a determinação das fibras variam muito de acordo com as condições 
de tratamento empregadas à amostra. Os métodos de análise recuperam de 60 a 80% de 
celulose e de 4 a 67% de lignina, em relação ao valor real existente na amostra, portanto não é 
uma medida segura ou específica dos grupos de substâncias existentes na amostra. 
Os equipamentos utilizados para a análise são: centrífuga de tubos, estufa (130ºC), 
dessecador, erlenmeyr, provetas, béquer, funil de Büchner, filtro de linho/algodão, cadinho e 
mufla. 
A porcentagem de fibras é calculada pela equação: 
 
amostradegramasn
fibradegramasnxppFibra
�
�100)/(% = 
 
2.1.7. Determinação de Sólidos Solúveis 
 
2.1.7.1. Definição 
 
A determinação de sólidos solúveis em materiais biológicos é uma medida muito 
utilizada no processamento e conservação de alimentos para avaliação de: 
• Maturação de frutas (qualidade e estabelecimento de preços, ex.: uva, laranja). 
• Elaboração de caldas (xaropes) para frutas em conserva. 
• Ponto final de processos de concentração (polpas concentradas, doces em massa, geléias). 
• Qualidade de sucos processados. 
 
2.1.7.2. Método para a determinação de sólidos solúveis 
 
A medida da concentração de sólidos solúveis de uma amostra é feita através do 
método refratométrico, simples e rápido, com bom grau de precisão. Utiliza como princípio o 
índice de refração de uma substância pura, que sendo constante, para determinada condição de 
temperatura e pressão, pode ser utilizado para a sua identificação. 
Desta forma, foi estabelecido o método para a determinação da concentração de sólidos 
solúveis em uma amosta, onde sabe-se que o índice de refração da água a 20ºC é 1,3330. A 
presença de sólidos solúveis na água resulta numa alteração destes índices. Conhecendo-se o 
índice de refração da solução aquosa, é possível determinar a quantidade de soluto presente na 
mesma. Esta propriedade é utilizada para determinar então a concentração de sólidos solúveis 
de soluções de açúcar. 
Em sucos de frutas, produtos de tomate, mel e xaropes, como o açúcar é o principal 
componente, a porcentagem sólidos solúveis pode ser considerado uma boa aproximação da 
 15 
porcentaagem de sólidos totais, sendo amplamente utilizada nos cálculos onde este valor é 
aplicado. 
O equipamento mais utilizado é denominado: de Refratômetro de Abbé. Sua utilização 
é simples, devendo apenas ser calibrado com água destiladaantes das determinações. Existem 
tabelas que permitem efetuar a correção devido a influência da temperatura: 
A leitura é realizada da seguinte forma: a amostra líquida, sem a presença de 
interferentes (como sólidos de cascas, etc.) é colocada sobre o prisma do aparelho, por onde 
passará um feixe de luz. Oresultado é lido imediatamente por uma escala existente no aparelho. 
O valor obtido da leitura é expresso em % sólidos solúveis ou ºBrix. 
 
2.1.8. Determinação de pH 
 
2.1.8.1. Definição 
 
A determinação do pH é uma determinação eletrométrica que avalia a concentração de 
íons hidrogênio em uma amostra. 
 
2.1.8.1.1. Importância: 
 
• Estado de conservação do produto: decomposição (hidrólise, oxidação, fermentação) � 
altera a concentração de íons H+; 
• Preservação e armazenamento do alimento: ácido inibe o crescimento de microorganismos 
e ação de enzimas. Os limites de crescimento de m.o. são estabelecidos pelos valores de 
pH; 
• Determina o tratamento térmico o qual o alimento deverá ser submetido: 
pH=4,5 – limite estabelecido para definição de tipo de tratamento térmico; 
pH<4,5 – alimentos ácidos – tratamento térmico mais brando (pasteurização); 
pH>4,5 – alimentos de baixa acidez – tratamento térmico mais drástico (esterilização). 
• Afeta as propriedades físicas de alguns alimentos, por exemplo: textura e ponto de 
gelificação de geléias de frutas. 
 
2.1.8.2. Método para a determinação do pH 
 
A determinação do pH é realizado em um equipamento denominado pHmetro ou 
potenciômetro (eletrodos). É uma determinação muito simples e amplamente utilizada nas 
indústrias de processamento de alimentos. Uma solução tampão é utilizada para calibrar o 
aparelho antes das medições. Normalmente são utilizadas soluções de pH 4 e pH 9. 
Escala: pH água pura, 22ºC = 7 (neutro), pH HCl = 0 (ácido), pH NaOH = 14 (básico). 
 
 16 
Tipos de amostra: 
• Amostras líquidas - a determinação de pH é feita diretamente na amostra simplesmente pela 
imersão dos eletrodos na mesma. 
• Amostras sólidas - diluir uniformemente 10g de amostra em 100ml de água a 25ºC, imergir 
os eletrodos na mesma e efetuar a leitura do pH. 
 
2.1.9. Atividade de água 
 
 2.1.9.1. Definição 
 
A quantidade de água presente em um alimento pode se encontrar na forma de água 
ligada e não-ligada. A relação entre o teor de água não-ligada ou disponível é denominada de 
atividade de água. Esse teor é designado como aa ou aw e é definido em termos de equilíbrio 
termodinâmico. É um número adimensional, resultado da pressão de vapor de água do produto 
pela pressão de vapor da água pura, à mesma temperatura. Varia numericamente de 0 a 1 e é 
proporcional à umidade relativa de equilíbrio. 
A quantificação do teor de água em produtos alimentícios é extremamente importante 
na sua preservação. A água numa matriz alimentícia pode exercer diversas funções, 
dependendo de sua disponibilidade e de outros componentes do alimento. 
 
2.1.9.1.1. Transformações nos alimentos 
 
A aw tem muita influência nas reações de transformações de alimentos, que podem ser 
microbiológicas, físicas e químicas. 
 
• Reações químicas: a aw afeta de maneira bem definida as velocidades das principais reações 
químicas de transformação dos alimentos; 
 
• Reações físicas: uma série de transformações física ocorre nos alimentos em função da aw, 
como a cristalização em geléias e doces de frutas; a recristalização de açúcares em balas 
vítreas e lactose em leite em pó; a redução do escoamento livre de pós secos; a perda de 
crocância em cereais desidratados; a aglomeração e empedramento de açúcar e pós secos; a 
adesão à embalagem de balas, caramelos e chicletes; etc; 
 
• Reações microbiológicas: o comportamento de microorganismos frente à aw é variável, 
dependendo da espécie, cepa microbiana, substrato, entre outros. No entanto, pode-se 
afirmar que as bactérias são usualmente mais exigentes quanto à disponibilidade de água 
livre, seguida dos bolores e leveduras. Os alimentos de baixa aw (< 0,60) são 
microbiologicamente estáveis. 
 
 17 
2.1.9.2. Métodos para a determinação da atividade de água 
 
Há uma grande diversidade de métodos para se medir a aw, que vai desde 
procedimentos simples (laboratoriais) no qual o produto alcança o equilíbrio em uma atmosfera 
de umidade relativa conhecida, até o uso de higrômetros de respostas rápidas (Decagon). 
A Tabela 3 apresenta alguns alimentos e tipos de microorganismos capazes de se 
desenvolver em determinada faixas de atividade de água. 
 
Tabela 3: Atividade de água de alguns alimentos e suscetibilidade à deterioração. 
Faixa de aw 
Microorganismos 
capazes de se desenvolver Alimentos com aw na faixa indicada 
1,00 – 0,95 Pseudomonas, Escherichia, 
Proteus, Shigella, Klebsiella 
Bacillus, Clostridium perfringers, 
Algumas leveduras 
Lingüiças, Salsichas, 
Pães cozidos, 
Alimentos contendo até 40% de sacarose e 7% de sal, 
Alimentos muito perecíveis: 
Frutas frescas, vegetais, carnes e peixe. 
0,95 – 0,91 Salmonella, V. parahaemolyticus 
C. Botulinum, Serratia, 
Lactobacillus, Pediococcus, 
Alguns fungos,Rhodotorula, Pichia 
Carnes curadas (presunto), 
Concentrado de frutas, 
Alimentos contendo até 55% de sacarose ou 12% de 
sal, Alguns queijos: Cheddar, suíço, provolone. 
0,91 – 0,87 Micrococus, 
Muitas leveduras: 
Cândida, 
Torulopsis, 
Hansenula 
Embutidos fermentados (salames), 
Bolos confeitados, 
Queijos desidratados, 
Margarina, 
Alimentos contendo até 65% de sacarose ou 15% de 
sal. 
0,87 – 0,80 Staphylococcus aureus, 
Saccharomyces spp., 
Debaryomyces, 
A maioria dos fungos 
Concentrados de frutas, 
Leite condensado, 
Farinha, Arroz, 
Granulados (contendo 15 a 17% de umidade), 
Bolos de frutas, Confeitos açucarados. 
0,80 – 0,75 A maioria das bactérias halófilas Geléias, Marmeladas, Marzipã, Glacê de frutas, 
Marshmallow. 
0,75 – 0,65 Saccharomyces bisporus, 
Fungos xerofílicos: 
Aspergillus chevalieri, 
A. candidus, 
Wallemia sebi 
Flocos de aveia (contendo 10% de umidade) 
Cremes para recheio, 
Geléias, 
Melaço, Caldo de cana de açúcar, 
Algumas frutas secas e castanhas. 
0,65 – 0,60 Leveduras osmofílicas: 
Saccharomyces rouxii 
 Poucos fungos: 
Aspergillus echinulatus, 
Monascus, Monascus bisporus 
Frutas secas (contendo de 15 a 20% de umidade) 
Balas, 
Caramelos, 
Mel. 
0,50 Sem proliferação microbiana Macarrão e massa similares (contendo 12% de 
umidade), 
Temperos (com 10% de umidade). 
0,40 Sem proliferação microbiana Ovo em pó (com 5% de umidade). 
0,30 Sem proliferação microbiana Biscoitos e torradas (com 3-5% de umidade). 
0,20 Sem proliferação microbiana Leite em pó (2 – 3% umidade), 
Vegetais desidratados (5% umidade), 
Flocos de milho (5% umidade), 
Sopas desidratadas. 
 
 
 18 
2.2. Análise microscópica 
 
2.2.1. Definição 
 
De acordo com AGUILERA e STANLEY (1990), define-se como microestrutura de 
alimentos a organização dos componentes de um alimento e suas interações. Ao sofrer 
processamento, a microestrutura do alimento é destruída e reconstituída, o que poderia ser 
entendido como uma série de operações e reestruturação e reorganização. 
 
2.2.1.1. Importância 
 
A estrutura do alimento é de grande importância em todos os aspectos de funcionalidade. 
Realmente, a organização microscópica de água e outros componentes do alimento governam 
as informações macroscópicas que estão sendo observadas através de instrumentação, isto é, 
podem ser criadas áreas muito heterogêneas no interior do alimento fazendo com que ocorram 
grandes modificações na estrutura e textura do produto final. 
Os parâmetros principais que influenciam grandemente tais propriedades são a atividade 
de água e a distribuição da mesma. Aumentando o conteúdo de água pode-se criarmudanças 
drásticas no estado físico dos alimentos. 
A migração de água é governada pelas diferenças de potenciais químicos de água entre 
duas zonas diferentes do produto. Esta migração pode ser limitada pela porosidade do material, 
a viscosidade da matriz sólida, e também as interações múltiplas nas quais a água é envolvida, 
depende também do coeficiente de difusão, temperatura, pressão, composição, fatores 
geométricos, etc. 
O reconhecimento da microestrutura de alimentos está agora sendo reconhecido como 
um pré-requisito necessário para entender suas propriedades. Todos aqueles que têm interesse 
de descrever, prever e controlar o comportamento de materiais alimentícios reconhecem a 
importância do verdadeiro reconhecimento da maneira como os componentes estão 
organizados, já que existe uma conexão causal entre estrutura e funcionalidade. Os métodos 
para o processamento de alimentos podem ser baseados no conceito de que mudanças na 
microestrutura afetam as propriedades do produto. Desse modo, técnicas de análise de 
microestrutura são necessárias para entender as relações estrutura-propriedades. 
 
2.2.2. Métodos utilizados na análise estrutural 
 
A microscopia (óptica, eletrônica ou atômica, confocal, de polarização) e outras 
técnicas de imagens (como ressonância magnética) são técnicas apropriadas para análise de 
estrutura de alimentos por ser somente um método analítico que fornece resultados em forma 
de imagens. Estas técnicas são utilizadas para examinar alimentos que sofrem processos 
semelhantes, podendo ser visualizado o comportamento do alimento em termos de morfologia 
e composição. 
 
 
 19 
2.2.2.1. Microscopia ótica 
 
Embora o advento das lentes eletrônicas tenha feito com que a microscopia óptica (MO) 
fosse deixada de lado em estudos estruturais, a descoberta da versatilidade desse instrumento, 
combinada com a facilidade de uso e preparo da amostra, fazendo dele uma ferramenta 
indispensável para a análise estrutural. 
A aplicação mais comum da microscopia ótica é a iluminação de campo brilhante em 
que a luz é transmitida de baixo através de um pequeno pedaço ou secção de material. A 
imagem é formada acima da amostra num tubo e visto por uma ocular com o tamanho 
ampliado e aproximadamente 10 a 100 vezes. Os espécimes são examinados a pressão 
atmosférica normal e não precisam ser desidratadas. Além disso, a preparação de amostras é 
relativamente fácil. Um dos recursos mais comuns da microscopia ótica de campo iluminado é 
aplicar tintura ou corante para aumentar o contraste ou diferenciar tecidos. 
 Na microscopia ótica, a coloração é um processo útil porque tecidos biológicos são 
comumente incolores e não oferecem contraste. 
 
2.2.2.2. Microscopia eletrônica de transmissão 
 
 Simples equipamentos de microscopia eletrônica de transmissão (MET) se tornaram 
disponíveis no final dos anos 30, e logo ficou evidente que produziam resolução melhor que da 
microscopia óptica. 
 Em sua forma mais simples, a MET parece-se com uma MO invertida. Um revólver 
eletrônico (filamento de tungstênio) é aquecido e emite estreitos raios de elétrons que viajam 
em alta velocidade. A voltagem aplicada para se obter essa aceleração é a ordem de 4 a 100kV. 
O raio de elétrons substitui a lâmpada da MO e age como uma fonte de iluminação. Como o 
olho humano não sensível a elétrons, a imagem fina, formada por elétrons que passaram pela 
amostra é focada numa tela fluorescente ou numa chapa fotográfica. 
Entretanto, a grande diferença entre microscópios ópticos e eletrônicos é que os elétrons 
precisam de um grande vácuo para viajar a distância usada na microscopia eletrônica. Essa 
necessidade de um meio sob alto vácuo combinada com a necessidade de um potente feixe de 
elétrons para passar através do material analisado limita severamente os tipos de amostras que 
podem ser examinadas, elas devem ser totalmente secas, extremamente firmes e fortes o 
suficiente para resistir aos danos causados pelo feixe de elétrons. 
 Alimentos geralmente apresentam dificuldades para o microscopista por causa de sua 
composição heterogênea e forma física. No entanto, métodos simples foram desenvolvidos para 
lidar com amostras problemáticas. Amostram particularmente trabalhosas são as gorduras e 
alimentos que contêm gorduras, já que sua microestrutura é dependente de temperatura. 
 
2.2.2.3. Microscopia eletrônica de varredura 
 
 A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é usada para examinar superfícies. A 
amostra é seca (MEV convencional) ou congelada abaixo de –80°C (cryo-MEV). Uma camada 
espessa de metal (ouro), responsável pela condutividade elétrica, é pulverizada sobre a amostra 
 20 
para poder ser visualizada. As imagens geradas pela técnica de MEV possuem bom foco e 
intensidade e são relativamente fáceis de serem entendidas. 
 O MEV destina-se basicamente ao exame de superfície das amostras, sendo que as 
superfícies internas das amostras também podem ser visualizadas desde que a amostra seja 
fraturada e exposta. Ótimos resultados de fratura são conseguidos com o congelamento da 
amostra empregando-se nitrogênio líquido e posterior fratura manual. Uma ampla faixa de 
aumentos pode ser usada (20x-100.000x) e a MEV pode alcançar uma profundidade de campo 
aproximadamente 500 vezes maior que a microscopia ótica. 
 Este tipo de microscópio é constituído de canhão eletrônico, lentes, circuito de 
varredura, coletor e ampliador de sinais, tubo de raios catódicos, sistema de vácuo, registro de 
imagens, controles. 
 Algumas dificuldades permanecem: a amostra ainda é exposta a alto vácuo, o que 
significa que desidratação total é necessária, e o material é bombardeado por um raio de 
elétrons que pode eventualmente danificar a amostra. 
 
 2.2.2.4. Microscopia confocal 
 
O microscópio confocal de fluorescência por varredura laser, referido apenas como 
confocal, utiliza a fluorescência para a aquisição das imagens. A fluorescência é um tipo de 
luminescência (emissão de luz) em que um corpo absorve luz e após um curto intervalo de 
tempo re-emite essa luz. 
Esse é o princípio da microscopia de fluorescência, na qual compostos químicos 
chamados fluoróforos são usados para produzir a fluorescência do material em estudo. O uso 
dos fluoróforos em biologia, por exemplo, acontece quando se quer localizar uma área 
específica da amostra (como uma proteína, por exemplo) ou para responder a um estímulo 
específico. A técnica de microscopia de fluorescência consiste justamente em captar este fóton 
que é emitido e com ele gerar umaimagem. 
O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para 
promover a excitação dos fluoróforos. Através de um conjunto de lentes o microscópio é capaz 
de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra a ser estudada. 
Mudando-se o ponto focal (mantida a profundidade) é possível iluminar todo o plano em 
estudo, ponto a ponto. 
A obtenção de imagens sucessivas de diferentes planos da mesma amostra possibilita 
construir imagens tridimensionais e imagens tridimensionais em movimento. O inconveniente 
desta técnica é a degradação dos fluoróforos, o que leva à utilização do confocal para o estudo 
de fenômenos mais rápidos, no caso de espécimes vivos, ou para estudar detalhes internos das 
células em espécimes vivos ou fixados. 
 
 
 
 
 
 
 21 
REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA 
 
A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists). Official Methods of Analysis. 16th edição. 
Washington, DC, EUA, 1997. 
A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists). Official Methods of Analysis. 17th edição. 
Gaithersburg, Maryland, 2000. 
AGUILEIRA, J. M.; STANLEY, D. W. Microstructural Principles of Food & Engineering. 1. ed. 
Cambridge: Elsevier Applied Science, 1990. 343p. 
ANTONIO, G. C. Influênciada estrutura celular e da geometria da amostra na taxa de 
transferência de massa do processo de desidratação osmótica de Banana Nanica (Musa cavendish) 
e de Mamão Formosa (Carica papaya L.). 2002. Dissertação (Mestre em Engenharia de Alimentos) 
Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2002. 
BOBBIO, P.A; BOBBIO, F.O. Química do processamento de alimentos. São Paulo: Varela, 1992. p. 
11-24. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985a. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, 
p.21-22. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985b. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, 
p.27-28. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985c. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, 
p.42-43. 
JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Foods Products. 1973. 970p. 
JOSLYN, M.A. Methods in Food Analysis - 2 ed. 1970. 845p.