Aula 6 Proteina

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Determinação do teor de proteínas 
Prof. Dra. Michelly C. Paludo 
Nutricionista, Mestra e Doutora em Ciência de Alimentos 
Contato: michellypaludo@hotmail.com 
O que são proteínas? 
2 
•São polimeros de alto peso molecular; 
•Polipeptídios formados por aminoácidos ligados por 
ligações peptídicas; 
 
 
 
 
•São hidrolisadas em aminoácidos por enzimas ou por 
aquecimento em meio ácido ou alcalino. 
Ligação Peptídica 
O que são proteínas? 
• São componentes fundamentais de estrutura e funções celulares, 
fornecendo nitrogênio, enxofre e aminoácidos essenciais ao 
organismo humano. 
• As proteínas podem serem distinguidas de lipídios e 
carboidratos, por conterem N na sua estrutura. 
• Apesar da sua complexidade estrutural, as proteínas podem ser 
hidrolisadas (quebradas) em seus constituintes aminoácidos por 
enzimas ou por meio de fervura com ácidos e álcalis sob certas 
condições. 
 
Estruturas das proteínas 
Estrutura planar 
Forças dipolares 
Forças de Wander Waals 
 
FORÇAS NÃO COVALENTES 
 
Pontes de H 
-Aminoácidos polares 
 
Ligações iônicas 
- Aminoácidos carregados 
 
 
Interações hidrofóbicas 
-Aminoácidos apolares 
 
Forças de Van der Waals 
-Qualquer aminoácido 
Proteína Proteína 
NH 
— CH 2 — OH ... O — C — CH 2 — CH 2 — 
2 
Proteína Proteína 
O 
— CH 
Ponte de Hidrogênio 
Interações hidrofóbicas 
e Forças de van der Waals 
2 
CH — CH 3 
CH 3 CH 3 
CH 3 — CH — CH 2 — 
— CH — CH 3 H 3 C — CH — 
CH 3 CH 3 
+ + — CH 2 — CH 2 — NH 3 O 
C — CH 2 — CH 2 — Ligação Iônica 
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura 
tridimensional de uma proteína ? 
Estruturas das proteínas 
Estrutura Primaria Das Proteína 
• A estrutura primaria de uma proteína se refere apenas à 
sequencia dos aminoácidos na sua cadeia peptídica, sem levar 
em consideração outros tipos de ligações como interações 
causadas por forças de Van Der Waals ou ligações de hidrogênio. 
 
• Da sequencia de aminoácidos, que é única para cada proteína, 
dependem as outras estruturas. 
Estrutura Segundaria Das Proteína 
As cadeias peptídicas não são esticadas, mas torcidas, 
dobradas ou enroladas sobre si mesmas, podendo então 
adquirir várias conformações. Entre estas conformações, as de 
menor energia livre, e portanto as mais estáveis, são aquelas 
nas quais todos os grupos NH das ligações peptídicas estão 
unidos aos grupos C=O por ligações de hidrogênio, o que leva 
à formação de duas organizações para as quais Pauling propôs 
as seguintes estruturas: uma, semelhante a uma folha de papel 
pregueada, estabilizada por ligações de hidrogênio 
intermoleculares e a organização α – hélices, na qual as 
cadeias peptídicas formam hélices contendo em cada volta, de 
3 a 5 unidades de aminoácidos, e que são estabilizadas por 
ligações de hidrogênio intermoleculares. 
Estrutura Terciaria Das Proteína 
A estrutura terciaria se refere a posteriores dobras e 
enrolamentos que as cadeias peptídicas sofrem, 
resultando em uma estrutura complexa e mais compacta 
para as proteínas. 
A conformação da cadeia de uma proteína é 
determinada única e exclusivamente pela sua estrutura 
primaria. 
A estrutura terciaria pode ser estabilizada por interações 
eletrostáticas, pontes dissulfeto, pontes de H e 
interações de Van Der Waals. 
Estrutura Quaternária Da Proteína 
Uma PTN natural pode ser formada por duas ou mais cadeias 
peptídicas associadas. Nesta associação, denominada estrutura 
quaternária das PTN, estão provavelmente envolvidas as mesmas 
ligações das estruturas secundarias e terciarias, com exceção das 
ligações covalentes. 
A formação da estrutura quaternária é principalmente devida ás 
superfícies hidrofóbicas das PTN. 
Na estrutura quaternária o pH é muito importante. 
As PTN com mais 30% de aminoácidos hidrofóbicos tem maior 
tendência de formar complexos quaternários. 
Classificação das proteínas 
Composição 
-Simples: albuminas (sol. em H2O), 
globilinas, gluteninas, prolaminas, histonas, 
escleroproteínas (insol. em H2O); 
-Conjugadas: cromoproteínas, lipoproteínas, 
fosfoproteinas, metaloproteinas e 
glicoproteínas. 
Número de cadeias 
polipeptídicas 
-Monoméricas 
- Oligoméricas 
Forma 
-Fibrosas (estrutura espacial + simples) 
-Globulares 
 
Funções das proteínas 
 Estrutural e Contrátil: proteínas miofibrilares 
“actina e miosina”, colágeno, elastina, queratinas 
 
 Catalisadores biológicos : enzimas 
 
 Hormônios: insulina 
 
 Transporte: hemoglobina 
 
 Antígenos/Anticorpos 
 
 Reserva: albumina, caseína (proteínas animais) 
 Nutricional: As proteínas são metabolizadas por enzimas 
proteolíticas e seus aminoácidos serão absorvidos e 
utilizados na síntese de novas proteínas. 
 
 Obs: Propriedades organolépticas e textura 
 
O valor nutritivo das proteínas depende... 
 Do conteúdo em proteínas; 
 Da composição em aminoácidos; 
 Da disponibilidade dos aminoácidos; 
 De digestibilidade de proteínas e absorção dos aminoácidos; 
 Da ausência de toxicidade e fatores antinutricionais 
 
 
Propriedades Funcionais das Proteínas 
• Propriedades de hidratação: absorção e retenção de água, 
humectância, inchamento, adesão, dispersabilidade, solubilidade e 
viscosidade 
 
• Propriedades relacionadas com as interações proteína-proteína: 
precipitação, formação de géis, fibras proteicas 
 
• Propriedades de superfície: tensão superficial, emulsificação e 
características espumantes das proteínas. 
Todas essas possibilidades de alterações 
fisicas além dos efeitos texturais e 
organolépticos podem também contribuir 
para alterar a reatividade quimica das 
proteínas!!! 
 
Ex1: Bebidas precisam ter solubilidade a diferentes pHs, 
estabilidade frente a aquecimento. 
 
Ex2: Prod. Lácteos: emulsificação, retenção de água, 
viscosidade, formação de espuma, gel e coagulação. 
Proteínas em Alimentos 
18 
 Origem animal: leite e 
derivados, ovos e vários tipos 
de carnes. Nos animais, as 
proteínas são consideradas 
como proteínas de Alto Valor 
Biológico (AVB). 
 Origem vegetal: grãos de 
cereais e leguminosas. As 
proteínas vegetais geralmente 
são deficientes em um ou 
mais aminoácidos essenciais. 
 
 
CONTEÚDO PROTEICO DE ALGUNS ALIMENTOS 
Leite integral 3.5% 
Leite me pó 22-25% 
Ovo integral 13% 
Ovo integral desidratado 35% 
Carne assada 25% 
Arroz integral* 7.5-9% (deficiente em metionina) 
Arroz polido 5-7.5% (deficiente em lisina) 
Farinha de trigo 9.8-13.5% (deficiente em lisina) 
Farinha de milho 7.0-9.4%(deficiente em lisina e triptofano) 
Soja 33-45%(deficiente em metionina) 
Amendoim 25-35%(deficiente em metionina) 
Batata 10-13% 
2,9% caseína 
0,6% soro 
59% clara 
30% gema 
Glúten: 75% proteinas 
Efeitos do processamento de alimentos 
protéicos 
Efeitos desfavoráveis 
• Alteração no valor nutritivo das proteínas; 
• Superaquecimento 
 
 
Efeito favorável 
• Aumento da digestibilidade ou da liberação de 
certos aa. 
-destruição de aa essenciais 
- novas lig. quim. (proteinas 
resistentes a enz. digestivas) 
21 
Métodos de determinação de proteínas 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
 Método de Dumas 
 Método por Biureto 
 Método de Lowry 
 Método de Bradford 
 Método Turbidimétrico 
 Métodos Físicos 
 Método Espectrofotometria ultravioleta 
Análise do 
nitrogênio 
Análise por 
grupos 
METODOLOGIAS DESENVOLVIDAS 
PARA ANÁLISE PROTEÍNAS 
Fundamentos: 
• Determinação através de um elemento ou grupo pertencente à 
proteína (A conversão para conteúdo de proteína é feito através de um 
fator!!!). 
• Ligações peptídicas 
• Ácidos aromáticos 
• Absortividade uv das proteínas 
• Grupos amino livres 
• Propiedades de dispersão da luz 
• Capacidade de adesão
de corantes 
 
Análise de carbono: 
 
Apresenta muitas vantagens na determinação de proteínas. A digestão da 
amostra é mais rápida que a determinação de nitrogênio. Devido a maior 
quantidade desse elemento, representa em média 55% do peso da 
proteína, em relação aos outros componentes, diminui os erros 
experimentais, além do que o fator de conversão é mais constante de 
alimento para alimento. 
Entretanto a grande dificuldade está em separar totalmente e 
quantitativamente o carbono de origem proteica e não proteica. 
Vantagens e desvantagens 
 
• Digestão é mais fácil do que para a determinação de nitrogênio 
 
• Diminui erros no resultado devido a grande quantidade de C em 
relação ao N 
 
• Fator de conversão é mais constante de alimento para alimento 
 
• Grande dificuldade está em separar o C protéico do não protéico 
24 
A conversão do nitrogênio orgânico total para conteúdo de proteína é 
feito através de um fator. 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
Alimento Fator 
Leites e derivados 6,38 
Arroz 5,95 
Trigo 5,70 
Amendoim 5,46 
Outros fatores de conversão de nitrogênio total em proteína 
25 
Método oficial 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
 
 
Princípio do método: 
 Determina o nitrogênio total (nitrogênio protéico e não protéico). A 
matéria orgânica é decomposta (etapa de digestão) e o nitrogênio 
existente será transformado em amônia e sua quantidade é determinada 
por volumetria. 
A quantidade de nitrogênio não protéico (aminoácidos 
livres, peptídeos, aminas, pigmentos nitrogenados) é muito 
pouca. Logo a interferência destes no resultado é pequena. 
26 
Método oficial 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
 
 
 
• O método envolve a estimativa do conteúdo total de 
nitrogênio do alimento e conversão da porcentagem desse 
nitrogênio para proteína, assumindo que todo nitrogênio no 
alimento é proveniente das proteínas. 
• O resultado do método também é chamado de nitrogênio 
total. 
• Como na maioria dos alimentos a quantidade de 
nitrogênio não proteico (aminoácidos livres, peptídeos, 
aminas, pigmentos nitrogenados) representa muito pouco, 
a interferência desses compostos no resultado é 
igualmente pequena. 
• O método original sofreu várias modificações, mas continua 
sendo ainda o mais utilizado na determinação de proteína. 
 
27 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
1) Preparo da amostra 
 
• Amostras líquidas ou úmidas: 5 mL (Kjeldahl) 
 2 mL (micro-Kjeldahl) 
 
• Amostras sólidas: 0,7 a 1,5 g (Kjeldahl) 
 0,2 g (micro-Kjeldahl) 
MÉTODO DE KJELDAHL 
1-DIGESTÃO 
2-DESTILAÇÃO 
3-TITULAÇÃO 
MÉTODO DE KJELDAHL 
O método de divide-se basicamente em 3 etapas: 
 
• Basicamente, a amostra é aquecida com ácido sulfúrico e digerida 
até que o carbono e hidrogênio são oxidados e o nitrogênio é 
reduzido e transformado em sulfato de amônio. 
• Então, é adicionada uma base forte, hidróxido de sódio, e pelo 
aquecimento há liberação de amônia (gás) que é coletada em um 
volume conhecido de um ácido padronizado, geralmente o ácido 
bórico a 10% e forma borato de amônia. 
• O ácido que não reagiu é determinado através de uma reação de 
neutralização e os resultados são transformados em % de proteína 
na amostra, através de um fator, já que o método não 
determina diretamente a proteína. 
30 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
Onde: V = volume da solução titulante gasto na titulação. 
 f = fator de conversão (6,25)* 
 P = peso da amostra 
3) Obtenção do teor de proteínas 
titulação: pode ser feita de duas formas 
Via direta - titula-se com um ácido forte. O número de equivalentes de 
HCl é igual ao número de equivalentes de NH4Cl (cloreto de amônia). 
 
Via indireta (método original): o NH3 é recolhido em HCl ou H2SO4 
(ácido sulfúrico) padronizado. O excesso de ácido que não reagiu é 
titulado com NaOH (hidróxido de sódio) padronizado. A desvantagem 
do método é que necessita de duas padronizações (HCl e NaOH). 
32 
VANTAGENS DESVANTAGENS 
Método e de referência para 
desenvolvimento de outros métodos 
Assume que todo o N é protéico 
Alta receptibilidade e reprodutibilidade 
 
Assume que todas as proteínas 
possuem a mesma % de N (16%). 
É o método mais utilizado Gases tóxicos do aquecimento do 
ácido sulfúrico 
Método de Kjeldahl (micro-Kjeldahl) 
33 
Método colorimétrico 
Princípio do método: 
 Substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um 
complexo de cor roxa com sais de cobre (Cu) em meio alcalino. A 
intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de proteína. 
Método por Biureto 
34 
Amostra + reagente* complexo (540 nm) 
*Reativo de Biureto = CuSO4 .5 H2O + NaOH + tartarato duplo Na e K 
Mantém o complexo Mantém o Cu+2 
Método por Biureto 
Análise 
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de 
uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que 
estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado. 
O cobre, em meio alcalino e na presença da proteína, reage com as 
proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. 
35 
VANTAGENS DESVANTAGENS 
Método simples e rápido Requer ao menos 2 a 4 mg de 
proteína por análise 
 
Menos caro que o método de Kjeldahl 
Pode ocorrer opacidade na solução 
final se estão presentes altas 
concentrações de lipídeos ou 
carboidratos 
Alta especificidade por não 
apresentar problemas de interferentes 
Deve-se padronizar mediante curvas de 
calibração com proteínas. 
Método por Biureto 
MÉTODO DE DUMAS (1831) 
Norg é transformado em Ngas e mede-se o volume 
Problema é medir o gás 
Só serva para amostras secas 
 
 
 O nitrogênio, através de pirólise (ruptura da estrutura molecular 
pela ação do calor), é transformado em N gasoso. Mede-se o 
volume de N2 e faz-se a conversão para % de proteína. A medida é 
muito difícil e sujeita a muitos erros. 
É muito mais rápido do que o método de Kjeldahl (4 minutos 
comparado a 1-2 horas para Kjeldahl). Não necessita produtos 
químicos ou catalisadores tóxicos. Muitas amostras podem ser 
medidas automaticamente. É fácil usar-se. Mas apresenta como 
desvantagem o custo inicial elevado. O tamanho de amostra pequeno 
torna difícil em alguns casos obter uma amostra representativa. 
PRINCÍPIO: 
As amostras são queimadas em alta temperatura (700-1000 graus). A 
quantidade de N liberada é quantificada por CG, com um detector de 
condutividade térmica (TCD). 
Processo: 
As amostras (100-500 mg) são pesados ​​em uma cápsula de estanho e 
introduzidas em um reator de combustão em equipamento 
automatizado. A quantidade de N liberada é medida por um GC. 
 
Vantagens: 
 1, aplicável a todas as proteínas, 
 2, sem produtos químicos perigosos; 
 3, economizando tempo: dentro de 3 minutos, 
 4, de alto desempenho: instrumentos automatizados pode analisar 
até 150 amostras. 
Desvantagens: 
Medidas de nitrogênio orgânico total, não apenas da proteína. 
ESPECTROFOTOMETRIA DIRETO 
FUNDAMENTO 
 
 As proteínas apresentam uma forte absorção a 280 nm uv, 
principalmente devido aos resíduos de triptofano e tirosina das 
proteínas. Já que as concentrações destes aminoácidos nas proteínas 
é bastante constante se pode utilizar a absorbância a 280 nm para 
estimar a concentração de proteínas usando a lei de beer. 
 
 
Abs = a .b.c 
 
Abs – Absorção 
a – absortividade da proteína 
b – caminho optico da luz 
c – concentração da proteína 
Vantagens 
 
• Método rápido e relativamente sensível (varias x mais sensível 
que o método de biureto) 
• Não existe interferência de sulfato de amônio e outros sais 
• Método não destrutivo 
• Utilizado em detecção pôs-coluna de proteínas 
 Desvantagens 
 
• Os ácidos nucléicos
também absorvem na região de 280 nm 
• O conteúdo de aminoácidos aromáticos difere 
consideravelmente em varias proteínas. 
• A solução deve ser clara e inodora. A turbidez pode produzir 
resultados erráticos 
• Se requer um sistema relativamente puro para utilizar este 
método 
MÉTODO DE LOWRY 
• FUNDAMENTO 
 
Combina a reação de biureto com a redução do reagente fenol do 
folin-ciocalteau (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico) para os 
resíduos de tirosina e triptofano das proteínas. A cor azulada 
desenvolvida é lida a 750 nm para baixas concentrações de 
proteínas (alta sensibilidade) ou a 500 nm para altas 
concentrações de proteínas (alta sensibilidade) 
 
VANTAGENS 
• Muito sensível 
• Menos afetado pela turbidez da amostra 
• Mais específico que a maioria dos outros métodos 
• Relativamente simples 
• Se pode completar em 1 a 1,5 horas 
DESVANTAGENS 
• A cor varia com diferentes proteínas (mais que o método de 
biureto) 
• A cor não é estritamente proporcional a concentração de 
proteínas 
• A sacarosa, lipídeos, tampões fosfato, monossacáridos e 
hexosaminas interferem com a reação 
• As altas concentrações de açúcares redutores, sulfato de 
amônio e compostos com sulfidrilas interferem com a reação 
FUNDAMENTO 
A amostra proteica se mescla com uma quantidade excessiva 
conhecida de um corante aniônico em uma solução tampão. 
 
 As proteínas se unem ao corante formando um complexo 
insolúvel. 
 
Se mede a quantidade de corantes não aderidos, solúveis posterior 
 ao equilíbrio da reação e a remoção do complexo insolúvel 
 acontece por centrifugação e filtração 
 
O corante não aderido esta inversamente relacionado ao conteúdo 
 proteico da amostra 
 
MÉTODO DE ADESÃO DE CORANTES 
CORANTES UTILIZADOS NESTE MÉTODO 
• ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO 
 LARANJA ÁCIDO 12 
 LARANJA G 
 NEGRO AMIDO 10B 
 Unem grupos catiônicos dos resíduos básicos de aminoácidos 
(imidasol da histidina, guanidina da arginina e o grupo ε-
amino da lisina) e o grupo livre terminal amino das proteínas. 
Vantagens 
 
•Método rápido (15 minutos ou menos) 
•Barato 
•Relativamente exato para análises de proteínas em alimentos 
•Pode utilizar-se para estimar as trocas de conteúdo de lisina 
disponível nos cereais durante seu processamento. 
•Não utiliza reagentes corrosivos 
•Não mede nitrogênio não proteico 
•Mais preciso que o método Kjeldahl 
Desvantagens 
 
•As proteínas diferem em seu conteúdo de aminoácidos básicos 
portanto diferem em sua capacidade de adesão ao corante 
•Se necessita elaborar curva de calibração 
•Muitos componentes não proteicos também podem aderir aos 
corantes, metais (Ca ou P) e causar erros nos resultados 
45 
Princípio do método: 
 A medida é baseada na turbidez causada pela proteína precipitada 
por algum agente precipitante, como ácido tricloroacético, 
ferricianeto de potássio e ácido sulfo salisílico. 
Método turbidimétrico 
46 
Método turbidimétrico 
VANTAGENS DESVANTAGENS 
É rápido 
 
Para amostras sólidas a proteína 
deve ser extraída para uma solução 
 Simples para amostras líquidas, onde 
a proteína está em solução. 
 
Pode haver precipitação de outras 
substâncias com as proteínas, 
causando interferência no método 
Depende de calibração com padrões 
conhecidos de proteínas determinados 
por outros métodos. 
MÉTODOS FÍSICOS: 
 
São vários os métodos físicos disponíveis, porém não são 
muito utilizados. São os seguintes: 
•índice de refração; 
•densidade específica; 
• viscosidade; 
•tensão superficial; 
•condutividade; 
•polarização. 
48 
DÚVIDAS ?