RELATORIO 4 - CARACTERIZAÇÃO DE PROTEINAS POR MEIO DE REAÇÕES DE COLORAÇÃO E ESPECTROFOTOMETRIA

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
CURSO DE BIOMEDICINA
Bioquímica 
Acadêmicos: Maria Eduarda Magnus 
	
 
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEINAS POR MEIO DE REAÇÕES DE COLORAÇÃO E ESPECTROFOTOMETRIA
Aula prática realizada pela turma da 3º fase de biomedicina no dia 16 de julho de 2020, na ausência do Professor Ricardo Andrez ministrada pela Professora Bethina Steiner. O objetivo desta aula era determinar a concentração de proteínas em material biológico a partir de métodos colorimétrico, e ainda relacionar as observações praticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de proteínas. 
O primeiro experimento chamado “Reações de coloração” onde determinarias as proteínas totais através da reação de Biureto. Preparamos seis tubos de ensaio com alguns reagentes.
Tubo B: 2,0mL de solução fisiológica + 1,0mL de reagente de Biureto;
Tubo 1: 0,5mL de padrão de proteínas BSA + 1,5mL de solução fisiológica + 1,0mL de reagente de Biureto;
Tubo 2: 1,0 mL de padrão de proteínas BSA + 1,0mL de solução fisiológica + 1,0mL de reagente de Biureto;
Tubo 3: 1,5mL de padrão de proteínas BSA + 0,5mL de solução fisiológica + 1,0mL de reagente de Biureto;
Tubo 4: 2,0mL de padrão de proteínas BSA + 1,0mL de reagente de Biureto;
Tubo 5: 1,5mL de solução fisiológica + 0,5mL de clara de ovo como amostra + 1,0mL de reagente de Biureto.
Em seguida, as tubos foram homogeneizados no vortex e incubados em banho maria a 30 – 37 ºC por 15 minutos. Após aquecidos, foram levados até a máquina de fotocolorímetro em 545nm, para tirar as medidas de absorbância tendo como sua referência de calibração o tubo B. 
Após recolher todos os dados da prática da reação de Biureto, determinou-se as proteínas totais a partir da curva padrão demostrada em dois gráficos para comparação dos mesmos, um feito à mão que está anexado ao final do trabalho, outro disposto logo abaixo. Para a realização dos gráficos foram calculados a quantidade de BSA (proteína) em mg de cada tubo, como posto abaixo. 
CONCENTRAÇÃO = MASSA / VOLUME
TUBO 1: 2,5 = m / 0,5 m = 2,5 x 0,5 m = 1,25 mg
TUBO 2: 2,5 = m / 1 m = 2,5 x 1 m = 2,5 mg
TUBO 3: 2,5 = m / 1,5 m = 2,5 x 1,5 m = 3,75 mg
TUBO 4: 2,5 = m / 2 m = 2,5 x 2 m = 5 mg
	Com os resultados de massa já obtidos, o gráfico com a equação da reta está disposto abaixo.
 
A equação da reta encontrada foi y = 0,0833x + 0,009 com sua resolução posteriormente, onde Y = ABS tubo 5 sendo 0,287 e X = quantidade de proteína em mg.
y = 0,0833x + 0,009
0,0833x + 0,009 – 0,287 = 0
0,0833x = - 0,009 + 0,287
0,0833 = 0,278
X = 0,278 / 0,0833
X = 3,33mg
	Após encontra a quantidade de proteína, foi feito o cálculo para saber a concentração em mg/mL dividindo a quantidade obtida no valor X e o volume pipetado da amostra do tubo 5, sendo 0,5mL.
C = 3,33mg / 0,5mL
C = 6,66mg/mL
O segundo e último experimento denominado “Determinação por espectrofotometria UV” foram utilizados dois novos tubos de ensaio com as seguintes amostras: 
Tubo Br recebeu: 3,0mL de solução fisiológica;
Tubo 7 recebeu: 2,5mL de solução fisiológica + 0,5mL de clara de ovo como amostra. 
Logo após, os tubos foram levados a máquina de espectrofotómetro UV à 280nm, assim medindo a sua absorbância. Com os dados já obtidos, realizou-se um cálculo da concentração de proteína em mg/mL utilizando a Lei de Lambert – Beer (A = 3bC)
A = Absorbância em espectrofotómetro encontrada (0,820)
3 = 31775 M-1 . cm-1 
b = 1cm
0,820 = 31775 M-1 . cm-1 x 1cm x C
C = 0,820 / 31775M-1
C = 0,00002581 L/mol
Encontrado a concentração, calculou-se a divisão do valor da massa molecular da proteína presente na clara de ovo sendo 45000g/mol dividido pelo resultado encontrado na concentração do cálculo acima. Esse segundo cálculo foi efetuado pois pede-se que o diâmetro da cubeta usado no experimento como sendo 1cm, mas foi usado 0,5cm na prática. Assim foi feito regra de 3 para igualar. 
X = 45000g/mol / 0,00002581L/mol 
X = 1,74L/g mol
Regra de 3:
1,74 ---- 0,5 x = 1,74 / 0,5 x = 3,4mg/mol
 X ----- 1 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
a. Diga qual o nome da proteína presente na clara do ovo?
Proteína albumina.
b. Compare os resultados obtidos na parte I e II (gráfico por papel milimetrado e excel) e da parte III, discutindo a precisão de cada caso e indicando qual você confiaria mais. 
Os resultados dos gráfico II e III foram consideravelmente parecidos, já o I teve alguma diferença de precisão, mesmo sendo pouca. Diante dos resultados obtidos, eu confiaria mais no gráfico feito pelo computador no qual dispõe da equação da reta, resolvendo-a obtive uma maior certeza da precisão do mesmo. 
 
absorbância	
1.25	2.5	3.75	5	0.112	0.22700000000000001	0.30499999999999999	0.433