Criopreservação

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CRIOPRESERVAÇÃO RESUMO
Conservação de células pelo frio.
Objetivos da criopreservação: conservar as células, que se dá pela redução do metabolismo de tal modo que a célula entre em letargia, mas isso deve ser reversível, depois que tira ela disso ela ainda mantem sua viabilidade/função.
3 tipos de criopreservação resfriamento, congelamento e vitrificação.
Vantagens da criopreservação: facilitar o transporte (embriões, células); menor custo; segurança maior em relação a riscos sanitários (para que o material seja comercializado ele precisa passar por algumas etapas visando eliminar possíveis patógenos que sejam carreados junto a ele); conservação genética (animais de produção ou com risco de extinção, guardar uma genética que la na frente pode ser uma válvula de escape se fizermos melhoramento genético errôneo); se consegue ter disponível o material genético mesmo que o animal de origem venha a óbito.
Os resultados vão depender principalmente: do meio de criopreservação utilizado, do agente crioprotetor, das curvas de congelamento e descongelamento (queda e retomada da temperatura), protocolo usado, variação individual (mais visível em certas espécies, como equinos). 
Toda vez que se conserva algum material/célula se tem dano celular, provocado pela desidratação celular ou cristalização, ou associação desses dois parâmetros, que provoca dano maior ou menor na célula. O dano é desencadeado principalmente pela velocidade de congelamento. Congelamento rápido – não dá tempo da agua intracelular conseguir sair, com isso se forma alto numero de cristais (quando a agua congela, ela muda seu arranjo espacial, formando esses cristais que podem romper ou lesar a membrana). Além disso, quando a agua congela se tem aumento de volume dela, forçando a membrana podendo levar ao seu rompimento. Com esse congelmaneto rápido também se tem menor desidratação.
Já quando há congelamento/queda de temperatura lenta não terá formação de cristais, mas terá intensa desidratação, oque é prejudicial, já que todas as reações químicas da célula ocorrem em meio aquoso, assim as reações não terão meio para ocorrer, acaba que a célula fica lesada por falta da manutenção da letargia viável.
Tanto no congelamento quanto no descongelamento existem momentos críticos:
· Congelamento: quando sai do -4º e vai para -60º
· Descongelamento: quando sai do -70º e vai para -20º
O ideal é manter um equilíbrio entre congelamento e descongelamento, e dependendo da célula e das condições em que eu estiver trabalhando, terá que congelar um pouco mais rápido ou um pouco mais lento.
Criopreservação de sêmen
Tem que promover redução do metabolismo, prevenir os danos de membrana (cauda, cabeça ou acrossomo), garantir longevidade dessa célula (ou seja, que ela possa ser usada por longo tempo). Com tudo isso, se consegue manter o espermatozoide fértil (manutenção da fertilidade) mesmo estando em estado de letargia.
Um dos fatores mais importantes é o meio, no caso os diluidores ou extensores seminais. Nesse meio tem que haver:
· fonte de carboidrato (energia), visto que nos espermatozoides não há citoplasma, e com isso não há reserva, quem faz a manutenção dessa célula no processo de letargia será o meio, se usa então glicose ou frutose;
· Fonte de proteína para possibilitar ao espermatozoide a continuação da produção de enzimas para manter seu metabolismo, mesmo que letárgico, então se usa gema de ovo, leite ou caseína;
· Fonte de lipídio, que não atua como fonte energética e sim para ajudar na manutenção da integridade de membrana, então se usa ácidos graxos solúveis, colesterol ou gema de ovo; 
· Como a célula ainda estará em constante atividade, há produção de resíduos que podem acarretar em redução do PH, por isso tem que botar tampão no meio, para garantir manutenção do PH e da atividade da célula, então se usa bicarbonato, TRIS ou fosfatos; 
· Como vai estar em um meio rico nesses nutrientes mencionados, é favorável à multiplicação de patógenos, então se adiciona antibióticos, penicilina, estreptomicina, polimixina B, etc. O recomendado é colocar o antibiótico em determinada concentração em que ele consiga inibir a multiplicação bacteriana, mas não muito elevada pois são letais a célula espermática. Também não pode usar de última geração ou mais potentes, pois pode-se induzir resistênia bacteriana. Em resumo sempre se usa antibióticos mais simples/antigos;
· Também se adiciona fonte de minerais, para manter atividade metabólica celular, se usa CaCl, KCl, MgSO4, NACl, NaH2PO4;
· Outros: sabões para dissolver um pouco a bicamada lipidica e facilitar a entrada dos crioproterores ou dos agentes usados para proteção da célula; anti-oxidantes, que ajudam a reduzir a peroxidação ou oxidação da membrana lipídica;
· Crioprotetores, que são substancias que protegerão a célula do frio. Podem ser:
- Extracelulares: não atuam dentro da célula, atuam alterando a osmolaridade do meio, tornam o meio mais hiperosmótico/concentrado, promovendo equilíbrio entre o meio interno e externo da célula, como o meio externo estará mais concentrado, a agua sai de dentro para fora, para tentar equilibrar a osmolaridade intra e extracelular. Oque se promove então é uma desidratação celular e com isso reduzir a formação de cristais durante o processo de criopreservação. Pode-se usar como crioprotetores extracelular a lactose, glicose, sacarose.
- Intracelulares: Entram dentro da célula, substituem a agua, como forma de possibilitar as reações metabólicas intracelulares. Mesmo em baixas temperaturas (criopreservação), não congelam e não formam cristais, não lesam a célula. Mas, a maioria deles disponíveis, em altas concentrações, assim como também em situação acima de 20 graus, lesam a célula. São eles o DMSO, etilenoglicol, glicerol. 
Em resumo, se opta pelo intracelular para reduzir os danos da cristalização.
Protocolos:
· Pode ser por meio automático (maquina faz todo o processo) ou manual (precisa de isopor comum, nitrogênio gelo e resfriador). Se o manual for feito de maneira adequada, se tem resultados tão bons quanto o automático.
Etapas da criopreservação:
· Diluição: diluição da amostra, pode ser simples ou então fazer primeiro a retirada do plasma seminal, tirar o sobrenadante e ressuspender o sêmen no diluidor.
· Resfriamento: sai de 36º a 38º (temperatura de coleta), e cai até que a mistura (diluidor + célula espermática) atinja 5º, ideal para entrada do crioprotetor intracelular dentro da célula, e para que ele não provoque danos para o espermatozoide.
· Envase (palhetas, pellets, ampolas, criotubo): coloca-se o material dentro de recipientes para poder fazer criopreservação.
· Congelamento: reduz de 5º para -70º ou -80º.
· Armazenamento: -196ºc. Ocorre em botijões de nitrogênio (é como uma grande garrafa térmica), o vácuo existente ajuda na manutenção da temp. O sêmen vai estar alojado em palhetas, ampolas ou criotubos, e são organizados nos raques, que são colocados dentro do canister para facilitar encontrar o material na hora de descongelar. Cuidados – manter o botijão em local mais fresco, protegido da luz e atritos. Em condições adversas se tem evaporação do nitrogênio, e, com isso, as células que estiverem mais na parte superior da raque entrarão em descongelamento, perda do material de forma gradual. Todo o material tem que estar mergulhado no nitrongenio (na verdade o recipiente que contem o material), para que assim se mantenha os -196º. Nível critico – quando chega em 15cm de nitrogênio, pois metade da raque não vai estar mergulhada em nitrogênio. Quando chegar em 17cm fazer reabastecimento, não tendo risco de perder o material que está em um nível mais alto.
· Descongelamento: sai de -196º para 36º. Aquecimento de forma adequada para reativar o metabolismo da célula, tirando ela do estado de letargia. 
- Material no pellets: meio liquido a 40ºC, esperar esse pellets diluir.
- Material em ampolas: água com gelo por 8 minutos, depois colocar ampola + água dentro do banho maria para aquecimento gradual até 36º.
- Material em palhetas: descongelamento lento35º por 30 segundos ou descongelamento rápido 70º por 8 segundos. Resultados melhores com descongelamento rápido. Não pode usar isso a campo porque 8 segundos é pouco tempo e pode matar a célula por calor. Tanto a campo quanto na clínica se usa descongelamento lento.
Depois de descongelar tem que avaliar motilidade, para saber se os espermatozoides conseguiram se manter viáveis durante processo de criopreservação.
Viabilidade pós descongelamento depende da espécie, indivíduo, motilidade. Pode ser feito o teste de termoresistência (TTR), onde mantem a temperatura do sêmen descongelado em 36º ou 40º por 3-20 horas, avaliar sequencialmente motilidade. Correlação baixa entre os resultados de TTR e a fertilidade real do sêmen, tem-se usado cada vez menos o TTR, se usa outros.
Independente do recipiente usado, sempre terão 3 regiões bem definidas no congelamento: 
· Externa: ocorre congelamento mais rápido dessas células, vão ter pouca desidratação e muita formação de cristal (excesso de danos pela cristalização).
· Mais interior: Demora mais para congelar, excesso de desidratação das células (mais danos de desidratação).
· No meio das duas camadas anteriores: Células terão congelamento ideal, não haverá dano pela formação de cristal nem desidratação.
Em resumo, nunca se conseguirá manter um congelamento ótimo em todo o recipiente. Sempre terá menor qualidade no sêmen criopreservado.
Criopreservação de embriões
A criopreservação de espermatozoides é mais fácil pois se lida com um único tipo celular, sem citoplasma. Já no caso dos embriões lida com quantidade maior e diferentes tipos celulares, que albergam diferentes quantidades de agua.
Congelamento para embrião não funciona tão bem, justamente pela variação de tipos celulares e número de células.
No congelamento se tem cristalização parcial ou total dos meios de criopreservação. Sempre se tem uso de um tipo de crioprotetor intracelular (glicerol, etilenoglicol ou propanodiol).
Na vitrificação se tem passagem direta do estado liquido para estado vitrificado e amorfo do meio, sem cristalização. Necessário associar pelo menos dois crioprotetores intracelulares (glicerol e etilenoglicol, glicerol e propanodiol ou propanodiol e etilenoglicol + sacarose, trealose ou galactose). Tem que associar desidratação muito rápida e queda rápida da temperatura, para que assim não haja formação de cristal. Processo mais complicado do que o congelamento. Mas para embrião é o que se tem obtido maiores resultados.
O sucesso do congelamento desses embriões depende de:
- Qualidade inicial do embrião.
- Estágio de desenvolvimento do embrião: estágios iniciais tem sucesso menor do que estágios mais avançados. Se congelar embrião no estágio de blastocisto expandido ou blastocisto em eclosão, também não se terá taxa de sucesso tão interessantes. O ideal é que se escolha estágio de desenvolvimento mais intermediário como mórula ou blastocisto inicial. Dependendo da espécie pode trabalhar com embrião de 16-34 células.
- Tempo entre coleta ou produção (in vivo ou vitro) e congelação. Quanto maior esse intervalo de tempo, pior será o resultado desse material criopreservado.
- Espécie. Algumas são mais fáceis essa criopreservação, pois se conhece mais dela.
- Tipo de crioprotetor.
- Protocolo.
Nunca se terá um material criopreservado que seja melhor que o fresco.
Máquinas de congelamento programável: congelamento com câmara cilíndrica com ar resfriado controlado por células termo-elétricas. Não tem como fazer o congelamento totalmente manual como é possivel no sêmen. Tem máquina que faz o processo todo de congelamento mas tem outras que tem que alternar com congelamento manual.
Congelamento dos embriões por método tradicional: Primeiro colocar embrião junto ao meio (crioprotetor); envasar em palhetas (mais fácil); colocar palhetas no aparelho de congelamento; fazer seeding = queda de temperatura brusca; resfriamento de -0,3º a -0,5º por minuto até -32ºC; fazer imersão e conservação no nitrogênio liquido.
Envase: Inicia com tampão, trabalha com um pouco de meio, depois colocar bolha de ar, na região no meio da palheta vai ter o embrião + meio, outra bolha de ar, meio e por fim o tampão para fechar a palheta. Se envasar o embrião do mesmo jeito que o sêmen, o embrião pode migrar dentro da palheta durante criopreservação e ele se aderir ao tampão, e quando for cortar o tampão para retirar a palheta ele vai embora junto. No caso de ovinos, se tem melhores resultados quando se trabalha com etilenoglicol ou DMSO. No caso de equinos sempre se usa palhetas de 0.5 ml, nunca com palhetas de 0.25 por causa do tamanho do embrião. Suínos são extremamente sensíveis ao frio, tem arranjo da membrana do embrião ou espermatozoide mais sensíveis a variação de temperatura.
Sêmen refrigerado suíno – 18º a 15º. Para as outras espécies – sêmen mantido a 5º.
Seeding – indução da cristalização com queda de temperatura muito rápida.
Na curva de congelamento de embrião se tem duas situações de queda brusca, diferente de sêmen, em que a queda de temperatura é constante durante o processo inteiro.
Descongelamento – depende do volume da palheta. 
 - 0,5 ml – deixar por 20 segundos no ar, mais 20 segundos em agua 37º.
 - 0,25 ml – deixar 15 segundos no ar e mais 20 segundos em água 37º.
Depois, fazer lavagem do embrião descongelado em meio com concentração decrescente de crioprotetor (para conseguir tirar todo ele do embrião). Começar fazer re-hidratação do embrião e retomada adequada da atividade metabólica dele.
Quando se trabalha com vitrificação (queda de temperatura de -2.000º por minuto). Como faz = coloca o embrião com o diluidor em palhetas, mergulhar em nitrogênio líquido. Não precisa de maquinas, pode ser manual, mas o profissional tem que ser muito bem treinado; reduz o tempo necessário para equilíbrio e resfriamento; diluição do crioprotetor em uma etapa simples e rápida após a descongelação; mais embriões descongelados e transferidos por unidade de tempo. Se consegue avaliar a viabilidade dos embriões por características morfológicas; sobrevivência embrionária pós-descongelamento; desenvolvimento in vitro até Bx; indução de prenhez; taxas de sobrevivência de embriões congelados x fresco.
FIMMM!!!