3ª PRÁTICA DE BIOQUÍMICA - Caracterização e Dosagem de Caseína no Leite.

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3ª PRÁTICA DE BIOQUÍMICA:
Caracterização e Dosagem de Caseína no Leite.
Alunas: Amanda Almeida, Caroline Reis, Gabrielle Alencar, Larissa Dessupoio e Larissa Venancio.
Professores: Priscilla Henriques e Fábio Lírio.
Prática realizada em: 18/05/2016
Entrega do Relatório: 25/05/2016.
Introdução
Proteínas são macromoléculas biológicas constituídas por uma ou mais cadeias de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os seres vivos e participam em praticamente todos os processos celulares, desempenhando um vasto conjunto de funções no organismo, como a replicação de ADN, a resposta a estímulos e o transporte de moléculas. Muitas proteínas são enzimas que catalisam reações bioquímicas vitais para o metabolismo. As proteínas têm também funções estruturais ou mecânicas, como é o caso da actina e da miosina nos músculos e das proteínas no citoesqueleto, as quais formam um sistema de andaimes que mantém a forma celular. Outras proteínas são importantes na sinalização celular,resposta imunitária e no ciclo celular. As proteínas diferem entre si fundamentalmente na sua sequência de aminoácidos, que é determinada pela sua sequência genética e que geralmente provoca o seu enovelamento numa estrutura tridimensional específica que determina a sua atividade.
  Uma proteína contém pelo menos uma cadeia polímérica linear derivada da condensação de aminoácidos, ou polipeptídeo. Os resíduos individuais de aminoácidos estão unidos entre si através de ligações peptídicas.      A sequência dos resíduos de aminoácidos em cada proteína é definida pela sequência de um gene, a qual está codificada no código genético. Durante ou após o processo de síntese, os resíduos de uma proteína são muitas vezes alterados quimicamente através de modificação pós-traducional, a qual modifica as propriedades físicas e químicas das proteínas, o seu enovelamento, estabilidade, atividade e, por fim, a sua função. Nalguns casos as proteínas têm anexados grupos não peptídicos, os quais são denominados cofatores ou grupos prostéticos. As proteínas podem também trabalhar em conjunto para desempenhar determinada função, agrupando-se em complexos proteicos. As proteínas podem ser purificadas a partir de outros componentes celulares recorrendo a diversas técnicas, como a precipitação, ultracentrifugação, eletroforese e cromatografia. Entre os métodos usados para estudar a estrutura e funções das proteínas estão a imuno-histoquímica, mutagénese sítio-dirigida, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa.
Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 270 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos).
 As ligações peptídicas das proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das Proteínas no meio.
O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180°C dará reação positiva com desprendimento de amônia, reação observada na figura 1:
Figura 1: Ureia – Biureto
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro-espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando comparado com outros métodos.
A espectrofotometria avalia a capacidade dos solutos absorverem luz em comprimentos de onda específicos, como pode-se observar na figura 2. A medida da luz absorvida permite inferir sobre a concentração do soluto e determinada solução. As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela lei de Lambert-Beer. Usando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A lei explica que há uma relação exponencial entre a transmissão de luz através de uma substância e a concentração da substância, assim como também entre a transmissão e a longitude do corpo que a luz atravessa. Se conhecemos l e α, a concentração da substância pode ser deduzida a partir da quantidade de luz transmitida. As unidades de c e α dependem do modo em que se expresse a concentração da sustância absorvente. Se a sustância é líquida, se deve expressar como uma fração molar. As unidades de α são o inverso do comprimento (por exemplo cm−1). No caso dos gases, c pode ser expressada como densidade (a longitude ao cubo, por exemplo cm−3), em cujo caso α é uma seção representativa da absorção e tem as unidades em comprimento ao quadrado (cm2, por exemplo). Se a concentração de c está expressa em moles por volume, α é a absorbância molar normalmente dada em mol cm−2. O valor do coeficiente de absorção α varia segundo os materiais absorventes e com o comprimento de onda para cada material em particular. Deve ser determinado experimentalmente.
Figura 2 - Espectrofotômetro
Objetivos
Caracterização e dosagem de Caseína no leite.
Materiais e Métodos
Materiais
Tubos de ensaio de vidro com e sem tampa;
pHmetro;
Bastão de vidro;
Pipetas de 1, 2, 5 e 10 mL;
Becher de 100 mL;
Estante para tubos de ensaio;
Funil de haste longa;
Papel de filtro;
Leite desnatado;
Solução de ácido clorídrico a 2%;
Solução mãe de caseína a 5 mg/mL;
Reagente de Biureto.
Métodos
	3.2.1. Precipitação isoelétrica da caseína e dosagem das proteínas do sobrenadante (PS):
	Em um bécher de 100 mL, foram adicionados 10 mL de leite e 10 mL de água destilada, nessa solução foi pipetado 0,8 mL de ácido clorídrico a 2% para que chegasse em um pH entre 4 e 5 ou formasse um precipitado, sendo o pH da caseína 4,6. O pH foi medido no pHmetro.
	Essa solução foi filtrada e em um tubo de ensaio foi adicionado 1mL do sobrenadante (Tubo 7).
	3.2.2. Dosagem de proteínas totais do leite (PT):	
	Em um tubo de ensaio foi adicionado 0.5 mL de leite e 9,5 mL de água destilada. Em um outro tubo de ensaio foi adicionado 1,0 mL do leite diluído (Tubo 8).
	3.2.3. Preparação da curva de calibração ou padrão de caseína:
	Foram preparados tubos de ensaio, contendo os componentes indicados na tabela abaixo para cada tubo, sendo os tubos 7 e 8 que já tinham sido previamente preparados (Tabela 1).
Diluições para preparação da Curva de calibração
Tabela 1 - Diluições para preparação da Curva de calibração
	Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	Solução mãe de caseína
	0
	0,2
	0,4
	0,6
	0,8
	1,0
	0
	0
	Água destilada (mL)
	1,0
	0,8
	0,6
	0,4
	0,2
	0
	0
	0
	Reagente de Biureto (mL)
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	Amostra (mL)
	0
	0
	0
	0
	0
	0
	1,0
	1,0
 A absorbância é determinada no espectrofotômetro a 540 nm, na ordem de leitura: Tubo 1 (zerar), 2-8. A curva padrão de caseína (concentração de caseína X Abs540nm)é construída utilizando os valores dos tubos 1-6. Os valores de concentração da caseína são calculados para cada tubo lembrando-se da concentração da solução mãe, o volume desta solução adicionado a cada tubo e o volume total dos tubos. A concentração das proteínas do sobrenadante (PS) e das proteínas totais (PT) é determinada através da plotagem dos valores dos tubos 7 e 8 na curva padrão construída. Fazer as correções necessárias levando em conta a diluição das amostras e expressar os resultados em gramas das proteínas por 100 mL de amostra (%p/v). A concentração da caseína é calculada através do seguinte cálculo: PT-PS= Proteína precipitada= caseína.
Resultados e Discussões
Caracterização e dosagem da caseína
Uma das formas de se realizar a separação é através do processo de precipitação isoelétrica, que consiste no ajuste de pH do meio ao valor onde a proteína tem carga total nula, ou seja, no ponto isoelétrico, pI. No ponto isoelétrico, as interações dos grupos de proteínas são fracas e a solubilidade da proteína alcança o valor mínimo. Esse ajuste de pH é feito com adições de pequenas quantidades de ácido clorídrico pouco concentrado para que não haja uma brusca mudança de pH e outras proteínas precipitem além da desejada. A proteína que foi separada era a Caseína, cujo pI = 4,6. O pH inicial era de 6,74 e foi ajustado até aproximadamente 4,62, valor aferido através de um phmêtro, com o acréscimo de algumas gotas de ácido, observou-se a formação de um precipitado branco. O precipitado formado era a caseína e as demais proteínas ficaram no sobrenadante.	
Teste com reagente de Biureto
	O método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos . As ligações peptídicas das proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das Proteínas no meio. O resultados das colorações podem ser visualizados na figura 3.
Figura 
3
 - 
Tubos de ensaio com contendo diversas
 concentrações de caseínas distintas.
Quanto maior a concentração de caseína na amostra, mais intensa é a coloração observada. A caseína representa cerca de 80% das proteínas encontradas no leite, sendo assim, o teste foi positivo, apresentando uma coloração violeta nos tubos, que foi aumentando gradativamente, conforme o aumento da concentração de caseína.
 
4.2. Esboço da curva padrão de dosagem da caseína
	Para o cálculo da concentração de proteínas totais e proteína no soro do leite, usou-se a regra C1V1 = C2V2, sendo C1 = Concentração do leite na solução mãe.
	Para construção da curva de calibração, tomou-se padrões de concentração conhecidos da solução de caseína 5 mg/mL (solução-mãe demonstrada na figura 4), diluindo esta da maneira desejada.
Figura 4- Solução de caseína 5 mg/mL. Essa foi a solução-mãe utilizada para o preparo dos tubos de 1 a 6.
As diluições foram as seguintes. Nos tubos 2, 3, 4 e 5, tomou-se respectivamente as proporções de caseína/água em 1:4, 2:3, 3:2 e 4:1. No tubo 1 adicionou-se apenas água e no tubo 6 apenas caseína 5 mg/mL. O tubo 7 continha apenas o soro do leite(1mL),filtrado após a precipitação das proteínas a pH=4,62 (proteínas do sobrenadante – PS) e o tubo 8 continha apenas 1mL de leite diluído em água (retirados da solução obtida através da mistura de 0,5 ml de leite + 9,5 mL de água destilada) na proporção 1:19 (proteínas totais – PT). Os dados estão representados na tabela 2 a seguir:
Tabela 2- Cálculo de concentração de caseína x absorbância.
	
	Branco
	Curva de calibração
	PS
	PT
	Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	Absorbância (nm)
	0
	0,038
	0,072
	0,107
	0,145
	0,183
	0,116
	0,128
	Solução-mãe
(mL)
	0
	0,2
	0,4
	0,6
	0,8
	1
	0
	0
	Água (mL)
	1,0
	0,8
	0,6
	0,4
	0,2
	0
	0
	0
	Biureto (mL)
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	5
	Amostra (mL)
	0
	0
	0
	0
	0
	0
	1
	1
	[ ] mg/mL de
caseína
	0
	1
	2
	3
	4
	5
	3,30
	3,64
Desta tabela, obteve-se a curva de calibração a seguir (Gráfico 1):
Figura 5- Gráfico 1: Curva de Calibração de dosagem de Caseína – Concentração de proteínas x Absorvância
Utilizando a equação da reta encontrada, y = 0,036x -0,0029, onde y= absorbância e x= concentração de caseína na amostra, calculou-se as concentrações de caseína nos tubos 7 e 8.
Tubo 7:0,116 = 0,036 x – 0,0029 x7 = 3,30 mg/mL
Tubo 8: 0,128 = 0,036x – 0,0029 x8 = 3,64 mg/mL
	4.3 Com estes valores, pôde-se calcular a concentração real da proteína no leite revertendo a diluição que fora feita antes.
Tubo 7 C7curva . 10 = C7 . 1 e C7 . 20 = C7real . 10
3,30 . 10 = C7C7 = 33,0
 33,0 . 20 = C7real . 10 C7real = 66 mg/mL = 6,60%p/v
Tubo 8 C8curva . 10 = C8real . 0,5
3,64 . 10 = C8real . 0,5C8real = 72,8 mg/mL = 7,28%p/v
Ccaseina = C8real (PT) – C7real (PS)
Ccaseína = 7,28 – 6,60 = 0,68%p/v
Teor de caseína em relação às proteínas totais do leite:
Figura 7 – Dados nutricionais do leite	De acordo com as informações nutricionais (figura 3 e 4), o leite continha uma quantidade de 6g/200mL de leite, ou seja, 6000mg/200mL = 30mg/mL. 
Figura 6 - Leite utilizado
 
Assim com o valor teórico de 3%p/v de proteína/leite, calcula-se qual porcentagem de caseína no leite corresponde a quantidade encontrada pelos cálculos em %p/v.
3,00%p/v ----- 100%
0,68%p/v ----- x X= 22,67 % de teor de caseína.
Conclusão
Após a realização da caracterização e dosagem de caseína no leite, e, por conseguinte a realização dos cálculos dos valores de concentração com base nos valores de absorbância obtidos, foi observado um valor teórico de aproximadamente 22,67% para o teor de caseína no leite. Como o teor de caseína aceitável é de 68 a 80% das proteínas totais do leite, pode-se concluir que o valor encontrado do teor de caseína não é aceitável, pois não está dentro da faixa proposta. Sendo assim, pode-se levar em consideração alguns fatores que podem ter diminuído o teor de proteínas totais do leite nas amostras, como a falta de proteínas degradáveis, falta de proteínas solúveis, forma como o leite é monitorado, o fornecimento de gordura adicional e também a forma como o leite é refrigerado, pH, dentre outros fatores.
Referências Bibliográficas
AUTOR DESCONHECIDO. Ligação Peptídica.Só Biologia. Disponível em <http://www.sobiologia.com.br/conteudos/quimica_vida/quimica10.php> . Acesso em: 19/05/2016
CISTERNAS, J.R. et. al. Fundamentos da bioquímica experimental. 2 ed. São Paulo: Atheneu,2001.
LEHNINGER, A. L. ET. AL. Princípios da bioquímica v. 1,2,3. 2. ed. São Paulo: Edgard Bluncher, 1976.
FARIA, R.A. Fatores nutricionais que interferem na composição do leite. Goiás, 2011. 45 f. Relatório de estágio curricular obrigatório (Graduação em Zootecnia) – Universidade Federal de Goiás, 2011.
CARDOSO, M. Compostos químicos. In: Caseína. Disponível em: <http://www.infoescola.com/compostos-quimicos/caseina/>. Acesso em 24/05/2016.