Determinação dos Parâmetros Cinéticos em uma Reação Enzimática

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Universidade Federal de Itajubá
Determinação dos Parâmetros Cinéticos em uma Reação Enzimática
Instituto de Recursos Naturais – Engenharia Química
Laboratório de Engenharia Química III
2017
Sumário
Introdução;
Objetivo;
Materiais e Métodos;
Resultados e Discussão;
Conclusão;
Referências Bibliográficas. 
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Introdução
Enzima:
Catalisadores que se ligam a reagentes específicos;
Conversão em produtos; 
Cinética enzimática:
Estuda a velocidade da reação;
Influência de parâmetros;
Determinação velocidade da reação:
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(1)
Fonte: Dutta , 2008.
FIGURA 1 - Concentração em função do tempo
Introdução
3/27
Fonte: Duarte , 2016.
FIGURA 2 - Enzima se complexa com o substrato para formar ES 
(2)
Objetivo
Cálculo dos parâmetros cinéticos (Km, Vmáx) para a enzima invertase, extraída da levedura Saccharomyces cerevisiae para diferentes métodos gráficos.
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Materiais e Métodos
Materiais:
Banho termostático; 
Balança analítica; 
Espátula; 
Béquer (50 mL); 
Balão volumétrico (50 ml); 
Sacarose (C12H22O11);
Solução da enzima invertase; 
Água destilada;
Cronômetro; 
Tubos de ensaio; 
Pipeta automática e de vidro (10 mL); 
Pêra;
DNS (Ácido dinitro-salicílico); 
Luvas de látex;
Espectrofotômetro 
Banho com água fervente e com água gelada.
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Materiais e Métodos 
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Métodos:
Preparo de 50 ml de solução de sacarose (10, 20, 30 e 50 g/l);
Verteu-se as soluções em balões volumétricos de 50ml para garantir precisão do volume;
Banho termostático (40ºC) por 5 minutos;
Adição de 100 μl de solução da enzima invertase em cada béquer de solução;
Retirada de alíquotas (500 μl) nos intervalos de 2, 4, 6 e 8 minutos de reação;
Inserção dos tubos de ensaio com as alíquotas em banho fervente;
Materiais e Métodos 
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Métodos:
Banho de gelo, após 5 minutos em banho fervente;
Preparo do branco com 0,5 ml de água destilada e 1 ml de DNS;
Adição de 1 ml de DNS em todas as soluções de sacarose;
Banho de água fervente por 5 minutos, seguido de banho de gelo;
Diluição das soluções com 10 ml de água destilada;
Leitura da absorbância em espectrofotômetro (540 nm), para cada solução preparada no início da prática (10, 20, 30 e 50 g/l);
Resultados e Discussão
A seguir são apresentadas a absorbâncias coletadas para cada amostra.
TABELA 1 – Tempo versus Absorbância
 
Fonte: Pessoal, 2017.
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Tempo (min)
ABSORBÂNCIA
5g/L
10g/L
20 g/L
30 g/L
50 g/L
80 g/L
2
0,003
0,000
0,001
0,057
0,034
0,033
4
0,008
0,002
0,0265
0,095
0,066
0,047
6
0,013
0,021
0,042
0,136
0,094
0,063
8
0,018
0,036
0,06
0,186
0,124
0,068
Resultados e Discussão
A Tabela 2 mostra os dados utilizados na construção da curva padrão.
TABELA 2 – Dados para curva padrão.
Fonte: Pessoal, 2017.
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Glicose (g/L)
ABSORBÂNCIA
0,05
0,005
0,10
0,022
0,20
0,051
0,40
0,128
0,80
0,229
Resultados e Discussão
A Figura 3 mostra a curva padrão.
FIGURA 3 – Curva padrão.
 Fonte: Pessoal, 2017.
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Resultados e Discussão
A partir da equação obtida pela curva padrão calculou-se as concentrações de açúcares redutores (ART) produzidos, demonstrado na Tabela 3.
TABELA 3 – Concentração de açúcares redutores.
Fonte: Pessoal, 2017.
Tempo (min)
ART (g/L)
5
10
20
50
80
2
0,0336
0,0237
0,0270
0,1356
0,1323
4
0,0500
0,0303
0,1109
0,2409
0,1784
6
0,0665
0,0928
0,1619
0,3331
0,2311
8
0,0829
0,1422
0,2212
0,4318
0,2475
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Resultados e Discussão
A Figura 4 apresenta o gráfico da concentração de açúcares redutores (ART) produzidos ao longo do tempo.
FIGURA 4 – ART versus tempo.
Fonte: Pessoal, 2017.
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Resultados e Discussão
 Por meio da regressão linear determinou-se a equação da reta para cada concentração.
TABELA 4 - Equações da reta e coeficiente de correlação.
Fonte: Pessoal, 2017.
Concentração (g/L)
Equação da reta e coeficiente de correlação
80
y = 0,0199x + 0,0978
R²= 0,9623
50
y = 0,049x + 0,0402
R²= 0,9994
20
y = 0,0317x - 0,0281
R²= 0,9883
10
y = 0,0209x - 0,0323
R²= 0,9262
5
y = 0,0082x + 0,0171
R²= 1
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Resultados e Discussão
 A velocidade é determinada por meio da equação 1 e, a partir dela, obteve-se a tabela 5:
TABELA 5 – Velocidades da reação enzimática.
Fonte: Pessoal, 2017.
Concentração (g/L)
5
10
20
50
80
V
(g/Lmin)
0,0082
0,0209
0,0317
0,0490
0,0199
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Resultados e Discussão
A partir do valor das velocidades enzimáticas foi construído o gráfico V versus [S], Figura 5.
FIGURA 5- Velocidade versus Concentração.
	Fonte: Pessoal, 2017.
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Resultados e Discussão
Para plotar o gráfico de Lineweaver-Burk utilizou-se a equação a seguir e os valores mostrados na Tabela 6.
	
TABELA 6 – Método de Lineweaver- Burk.
Fonte: Pessoal, 2017.
1/V (Lmin/g)
1/S (L/g)
121,95
0,20
47,85
0,10
31,56
0,05
20,41
0,02
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(3)
Resultados e Discussão
Gráfico de Lineweaver- Burk.
FIGURA 6- Gráfico de Lineweaver-Burk.
Fonte: Pessoal, 2017.
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Resultados e Discussão
Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx obtidos através da equação 3, da seguinte forma:
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Resultados e Discussão
Em seguida, aplicou-se o método de Langmuir que utiliza a equação abaixo e os valores da Tabela 7.
TABELA 7 – Método de Langmuir. 
Fonte: Pessoal, 2017.
[S]/V (min)
[S] (g/L)
609,756
5
478,469
10
630,915
20
1020,41
50
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(4)
Resultados e Discussão
Gráfico de Langmuir, Figura 7. 
FIGURA 7 – Gráfico de Langmuir.
Fonte: Pessoal, 2017.
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Resultados e Discussão
Os parâmetros cinéticos, Km e Vmáx, determinados pela linearização de Langmuir (equação 4), foram determinados da seguinte maneira:
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Resultados e Discussão
Segundo Gáscon et al. (1981) a constante de Michaelis-Menten (Km) da invertase obtida da Saccharomyces cerevisiai é igual a 26 g/L sacarose. A partir deste, calculou-se o desvio relativo.
TABELA 8 – Desvio relativo.
Fonte: Pessoal, 2017.
 
Desvio (%)
Langmuir
37,674
Lineweaver-Burk
87,710
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(5)
Resultados e Discussão
Possíveis fontes de erro:
Tempo de realização do experimento;
Retirada da alíquota do meio reacional;
Preparo da solução;
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Resultados e Discussão
Variáveis que influenciam o experimento:
Controle da temperatura;
Importância do banho com água a 100 ºC;
Concentração de substrato sobre a velocidade da reação enzimática;
Vantagens e desvantagem dos métodos de Lineweaver-Burk e Langmuir.
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Conclusão
Inibição pelo substrato;
Temperatura ótima;
Discrepância entre os resultados;
Melhor método obtido.
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Referências Bibliográficas
GÁSCON, S.; NEUMANN, N.P.; LAMPEN, J. O. Comparative study of properties of purified internal and external invertases from yeast. Journal of Biological Chemistry, v. 243, p. 1573-1577, 1968.
DUARTE, S. H. Aula 07: Cinética enzimática e inibição, Engenharia Bioquímica. Instituto de Recursos Naturais, Universidade Federal de Itajubá. Itajubá – MG, 2016.
DUTTA, Rajiv. Fundamentals of Biochemical Engineering. 1ª ed. Nova Delhi, Índia. Springer. Madrid 2008. 
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Obrigada pela atenção!