S.aureus corrigido

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Mirela Fernanda Guida	83173
Pesquisa de Staphylococcus aureus em queijo parmesão 
Biomedicina 9º período
Relatório final apresentado ao curso de Biomedicina noturno do Centro Universitário Hermínio Ometto, como parte integrante do estágio supervisionado obrigatório.
SUPERVISORA DE ESTÁGIO: Ma. Nayara K. Scharlack
ARARAS/SP
MAIO/2018
INTRODUÇÃO
As bactérias do gênero Staphylococcus são anaeróbias facultativas, pertencentes a família Micrococcaceae, sendo cocos gram-positivos e que possuem a habilidade de se multiplicarem em meios que apresentam NaCl nas faixa de 10% a 20% (FRANCO; LANDGRAF, 2004)
São de importância alimentar, pois os S.aureus produzem enterotoxinas que podem provocar intoxicação quando consumidos. Geralmente este gênero de bactérias é encontrado em lesões da pele e nas vias aéreas superiores dos homens, portanto, um alimento muito manipulado por humanos poderá facilmente ser contaminado por este tipo de bactéria, indicando uma má higiene e sanificação por parte de quem manipulou o alimento (FRANCO; LANDGRAF, 2004). 
Por serem bactérias mesófilas, crescem em uma faixa de temperatura de 7ºC a 47,8ºC, suas enterotoxinas são produzidas em temperaturas de 10ºC e 46°C. De acordo com Franco; Landgraf (2004), as intoxicações alimentares ocorrem quando os alimentos são deixados nesta faixa de temperatura por um tempo variável. Segundo Jay (2005) a produção de enterotoxinas, que geralmente é associada a S.aureus coagulase positiva, também pode ser identificado em outras espécies. 
Segundo o Centro de Vigilância Epidemiológica (2013) a intoxicação alimentar estafilocócica é conhecida por apresentar náuseas, vômitos, cólicas e diarreia, geralmente tem início abrupto, e em casos mais graves pode acontecer desidratação, dores de cabeça, dores musculares e alterações na pressão sanguínea e frequência cardíaca. Além disso o Centro de Vigilância Epidemiológica (2013) tem como medida de controle: a notificação de surtos imediata para que seja possível identificar a fonte; medidas preventivas: educar e instruir manipuladores de alimentos, orientações para a correta limpeza do local de preparo e manipulação do alimento, assim como de todos os utensílios utilizados no seu processamento, controle da temperatura em que o alimento é exposto. 
Segundo Ataíde (2008) por conter muitos nutrientes, o leite torna-se suscetível ao crescimento de microrganismo, que podem ser adquiridos do próprio animal, do manipulador ou do ambiente em que o alimento é manipulado. Uma parte do leite produzido no Brasil é destinada a produção de queijo.
Amostras contaminadas, em circulação no mercado, favorecem a ocorrência de doenças veiculadas por alimentos, evidenciando a importância das condições higiênicos sanitárias tanto do manipulador quanto do ambiente e do animal que fornece a matéria prima (ABRAHÃO et al., 2008; BORGES et al., 2008; SENGER; BIZANI, 2011 apud SOUZA et al., 2017).
 
OBJETIVO
Analisar a presença da bactéria Staphylococcus aureus em queijo parmesão por meio de cultivos em meios específicos, e indicá-lo como próprio ou impróprio para consumo.
METODOLOGIA 
Preparo do ágar Baird Paker – BP 
Fez-se o seguinte cálculo:
25 x 3 = 75 90
60 ---- 1000
 x ---- 90 x = 5,4g
Em uma balança analítica digital pesou-se 5,4g do ágar e o diluiu em 90mL de água destilada, para a completa diluição do ágar, utilizou-se do bico de Bunsen, onde o ágar foi mantido até a sua completa homogeneização. Em seguida, o ágar foi levado a autoclave a 121ºC por 15 minutos para sua esterilização.
Preparo do Telurito de potássio 1%
Calculou-se:
1 ---- 100
x ---- 50 x = 0,5g
Pesou-se em uma balança analítica digital, 0,5g do soluto, e o diluiu em 50mL água destilada, após diluída, a solução foi armazenada em um frasco e sob refrigeração. 
Preparo da solução fisiológica 0,9%
Calculou-se:
0,9 ---- 100
 x ---- 200 x = 1,8
Em uma balança analítica digital, pesou-se 1,8g do sal e o diluiu em 200mL de água destilada, a solução foi levada a autoclave por 15 minutos a 121ºC para completa esterilização.
Preparo da emulsão de gema de ovo
Em uma capela de fluxo, com a ajuda de uma balança analítica digital, fez-se a separação da gema do ovo e da clara, após completa separação, a gema foi pesada em uma Becker estéril. Sua diluição foi feita em solução fisiológica 0,9% na proporção 1:1.
Diluição do alimento
Em uma capela de fluxo, com uma balança analítica digital, pesou-se 10g do queijo parmesão em saco estéril, em seguida, adicionou-se 90mL de água peptonada, essa ficou identificada como diluição 10⁻¹. Para a diluição 10⁻², pipetou-se 9mL de água peptonada em um tubo estéril, e acrescentou-se 1mL da diluição 10⁻¹. Na diluição 10⁻³, pipetou-se 9mL de água peptonada em um tubo de ensaio estéril e acrescentou-se 1mL da diluição 10⁻².
 Suplementação do ágar
Para a suplementação do ágar fez-se os seguintes cálculos:
- Emulsão de gema de ovo:
50 ---- 1000
 x ---- 90 x = 4,5mL
- Telurito de potássio 1%
10 ---- 1000
 x ---- 90 x = 0,9mL
Em uma capela de fluxo, após o ágar ser esterilizado e previamente resfriado, fez-se a suplementação adicionando 4,5mL da emulsão de gema de ovo, e 0,9mL de telurito de potássio 1%, homogeneizou-se e verteu-se o ágar em placas de pétri estéreis. 
Inoculação e incubação das amostras
Após a solidificação do ágar, as placas foram identificadas como 10-1, 10-2 e 10-3. Adicionou-se 0,1mL das amostra em suas respectivas placas, utilizou-se a técnica spread plate para o espalhamento das amostras no ágar. A incubação foi feita em estufa a 37ºC por de 24 a 48 horas.
Após incubação, observou-se o crescimento característico das colônias de Staphylococcus aureus, com centros negros e um halo transparente em volta.
Preparo do ágar TSA para provas bioquímicas
Fez-se o seguinte cálculo:
25 x 3 = 75 90mL
40 ---- 1000
 X ---- 90 x = 3,6 
Pesou-se 3,6g do ágar TSA em uma balança analítica digital e o diluiu em 90mL de água destilada. O ágar foi levado ao bico de Bunsen para sua completa diluição. Após diluído foi autoclavado a 121ºC por 15 minutos. 
Em seguida, verteu-se o ágar em placas de pétri estéreis e esperou-se a solidificação. 
Depois de solidificado, identificou-se as placas como 10-1, 10-2 e 10-3, as amostras foram inoculadas em suas respectivas placas pela técnica da estria simples, a incubação foi feita a 37ºC por 24 horas.
Provas Bioquímicas para confirmação de S.aureus
Catalase
Em uma lâmina, em volta do bico de Bunsen, coloca-se uma gota de peróxido de hidrogênio 3%, em seguida, com uma alça de platina é adicionado uma colônia da amostra que se deseja pesquisar. Em resultados positivos é possível observar a formação de bolhas quando ocorre o contato da colônia e do peróxido de hidrogênio 3%, em resultados negativos isso não ocorre. 
Manitol
111 ---- 1000
 x ---- 90 x = 9,9g
Pesou-se, em uma balança analítica digital, 9,9g do ágar manitol e o hidratou em 90mL de água destilada, dissolveu-se completamente com a ajuda do bico de Bunsen e autoclavou-se a 121°C por 15 minutos. A inoculação da amostra foi feita com uma estria simples, a partir do ágar TSA, em seguida, o ágar foi levado a estufa a 37°C por de 24 horas. Em resultados negativos, o ágar continua com sua coloração normal, ou seja, vermelho. Em resultados positivos, a coloração do ágar muda de vermelho para amarelo.
DNAse
42 ---- 1000
 x ---- 90 x = 3,7g
Pesou-se, em uma balança analítica digital, 3,7g do ágar e o hidratou em 90mL de água destilada.O ágar foi dissolvido completamente no bico de Bunsen, e em seguida foi autoclavado a 121°C por 15 minutos. Após a solidificação do ágar, inoculou-se uma alçada do ágar TSA no ágar DNAse, fazendo apenas um risco no centro do ágar, em seguida o ágar foi levado a estufa onde permaneceu por 24 horas a 37°C. Após incubação, adicionou-se HCL 1M acima das colônias e aguardou-se os resultados. Em resultados positivos, após a adição de HCL 1M, ocorre a formação de um halo transparente em volta da inoculação. Isso não ocorre em resultados negativos.
Coagulase
Em um tubo estéril, adicionou-se 500µL de plasma e inoculou-se uma alçada da colônia, proveniente do meio TSA, a ser pesquisada. O tubo foi incubado a 37°C por de 4-24 horas. Em resultados positivos ocorre a formação de um coagulo, e em negativos não ocorre a formação.
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
RESULTADOS
 	Na pesquisa de S.aureus em meio Baird Paker em queijo parmesão foram selecionadas apenas as placas que obtiveram crescimento de 20 a 200 colônias, os resultados foram apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Contagem de colônias de S.aureus em queijo parmesão
	Contagem de Staphylococcus aureus em queijo parmesão
	Diluição
	Resultado
	10⁻¹
	> 200 UFC/g
	10⁻²
	98 UFC/g
	10⁻³
	21 UFC/g
 Fonte: Própria
Levando em consideração a quantidade de colônias obtidas, as placas selecionadas para se obter a quantificação de UFC/g foram as placas 10⁻² e 10⁻³, então fez-se o seguinte cálculo:
UFC/g 
UFC/g = = 1190 x 100 x 1000 = 11,9 x 107
Após a contagem em placas, foi feito o cultivo das colônias características do meio BP para o ágar TSA. As colônias do meio TSA foram utilizadas para a realização das provas bioquímicas para confirmação da presença de Staphylococcus aureus. A primeira prova bioquímica realizada foi a de catalase que difere o gênero Staphylococcus do Streptococcus, e a partir dela, definiu-se se seriam feitas as outras provas, ou seja, o restante das provas bioquímicas só foi realizado em placas que obtiveram catalase positiva. A prova de catalase é positiva quando o microrganismo estudado possui a enzima catalase, essa quando em contato com o peróxido de hidrogênio o quebra, liberando O2 e H2O, esse O2 é possível ser observado nas bolhas que são formadas quando a colônia entra em contato com o peróxido de hidrogênio. Os resultados foram expressos na tabela 2
Tabela 2: Resultados das provas bioquímicas para identificação de S.aureus (catalase, manitol, coagulase e DNAse)
	Provas bioquímicas para S.aureus
	Resultados das provas bioquímicas para confirmação de S.aureus
	 
	10-1
	10-2
	10-3
	Referências
	Manitol
	positivo
	positivo
	positivo
	Positivo
	DNase
	negativo
	negativo
	negativo
	Positivo
	Coagulase
	negativo
	negativo
	negativo
	Positivo
	Catalase
	positivo
	positivo
	positivo
	Positivo
 Fonte: Própria
Foram considerados positivos as provas de manitol que apresentaram alteração da coloração do ágar, passando da cor vermelha para amarela, esta alteração na cor acontece pela fermentação do açúcar manitol feito pela bactéria, quando ocorre a fermentação tem mudança no pH do ágar, e o indica a mudança no pH, é a alteração da cor. A prova de DNAse teve resultado negativo, porém em uma amostra positivada, seria característico a formação de halo claro em volta do inoculo contendo a bactéria, este halo seria formado após a adição de HCL 1M, o ágar DNAse possui ácidos nucleicos e alguns microrganismos tem a capacidade de romper as bases nitrogenadas, assim como o S.aureus, o HCL 1M revela se houve ou não essa quebra. E a prova de coagulase positiva-se quando ocorre a formação do coagulo no tubo que contém o plasma e o inoculo da amostra, a coagulação acontece quando o microrganismo é capaz de produzir redes de fibrina, coagulando o plasma.
DISCUSSÃO
Segundo a ANVISA (2004), para a identificação e confirmação da presença de Staphylococcus aureus as provas bioquímicas devem obter os seguintes resultados: Coagulase – positivo, esse resultado é encontrado pois na parede celular da maioria das cepas de S.aureus possui o fator aglutinante, este quando em contato com o fibrinogênio do plasma, coagula, levando a positividade do teste. Catalase – positivo, deve-se observar se o microrganismo possui a presença da enzima catalase, que quebra o peróxido de hidrogênio liberando O2, quando positivo é possível observar a formação de bolhas. DNAse – positivo, se há presença de S.aureus, o ácido nucleico presente no ágar será quebrado, o ácido clorídrico 1M revela se houve ou não a quebra. Manitol – positivo, utilizado para observar se o microrganismo tem capacidade de fermentar o manitol e então alterar o pH do meio, quando ocorre a alteração do pH o ágar fica amarelado, quando não ocorre, o ágar continua vermelho.
O resultado encontrado nesta pesquisa, mostrou que se tratava de uma bactéria do gênero Staphylococcus, porém não era da espécie aureus. Apesar do crescimento característico de S.aureus em ágar BP, as provas bioquímicas indicaram que a bactéria presente nesta amostra não era Staphylococcus coagulase positiva, ou seja, a espécie encontrada não era a S.aureus. 
Em estudo publicado por Ataíde et al. (2008), onde traçaram um perfil microbiológico do leite pasteurizado obteve-se resultados de 3,9x104 UFC/mL para Staphylococcus coagulase positiva, estando dentro dos padrões exigidos, e 2,7x104 UFC/mL para Staphylococcus coagulase negativa. 
Souza et al. (2017) em estudo que teve como objetivo avaliar as condições microbiológicas de queijo Minas frescal tanto de produção independente, quanto de produção industrial, no total foram analisadas 50 marcas, dessas 16 tinha contagem de Staphylococcus coagulase positiva acima do padrão, e em 10 amostras foi possível confirmar a presença de S.aureus, indicando que baixa qualidade microbiológica. 
Pereira et al. (2017) quando pesquisou a presença de Staphylococcus aureus em queijo de coalho produzidos no Rio Grande do Norte observou que as amostras apresentavam contagens altas para S.aureus, indicando que o alimento não estava próprio para consumo.
Mottin et al. (2017) analisando os parâmetros microbiológicos de queijo minas frescal de uma região da Bahia, observou que 100% das amostras apresentaram resultados muito acima do padrão para S.aureus, foram analisadas três marcas que foram identificadas como A, B e C, sendo que a marca que conteve a maior contagem foi a A com 630.000 UFC/g, indicando que este alimento estava em péssimas condições microbiológicas.
Momesso et al. (2016) pesquisou a qualidade microbiológica de produtos lácteos infantil em um Hospital Universitário no sul de Minas Gerais, onde foram colhidas amostra em quatro dias diferentes, na primeira coleta observou-se que a contagem de Staphylococcus aureus era baixa, não apresentando riscos, na segunda coleta, não houve crescimento bacteriano no ágar seletivo para esta bactéria, na terceira coleta e quarta coleta não houve crescimento bacteriano.
CONCLUSÃO
Diante dos resultados encontrados, pudemos observar que a bactéria presente nesta amostra de queijo parmesão não se tratava de Staphylococcus coagulase positiva, não sendo capaz de inferir se a amostra está própria ou imprópria para consumo. Os altos valores de UFC/g nos indicam que apesar de não ser S.aureus, esta amostra apresenta certos níveis consideráveis de contaminação.
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