CARACTERIZACAO DE PROTEINAS - Bromatologia

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Prof. Dr. Pedro Torquato
 São macromoléculas resultantes da
condensação de moléculas  aminoácidos
através da ligação peptídica.
 As proteínas são polipeptídios que resultam na
condensação de até milhares de moléculas de
 aminoácidos. As sua macromoléculas
possuem pesos moleculares variados desde
alguns milhares até vários milhões.
 QUANTO À NATUREZA DO GRUPO R
 Aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptofano;
 Básicos: lisina, histidina;
 Ácidos: Ac. Glutâmico, Ac. Aspártico,..
 Ramificados: isoleucina, leucina, valina;
 Sulfurados: metionina, cisteína, cistina;
 Outros : treonina.
Ligação Peptídica e resíduo de aa
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS.
PRIMÁRIA: é a sequência linear dos aminoácidos unidos pelas ligações peptídicas.
SECUNDÁRIA: Dobras helicoidais da sequência linear. Essas
dobras são mantidas por pontes de hidrogênio.
TERCIÁRIA: Dobras na estrutura helicoidal.
QUATERNÁRIA: É a
estrutura funcional e
efetiva da proteína .
Qualitativo quantitativo
Métodos qualitativos e quantitativos:
Vantagens e desvantagens de cada um
Biureto 
Ninhidrina 
Sakagushi 
Aminoácidos Sulfurados
Biureto (ligações peptídicas 2 ou 3 aa)
Ninhidrina (grupos amina)
Sakagushi (guanidina da arginina)
Aminoácidos Sulfurados (cistina e cisteina)
Controle Controle positivo Controle negativo
REAÇÃO amostra ovo Controle Controle + Controle -
BIURETO
NINHIDRINA
SAKAGUSCHI
AMINOÁCIDOS
SULFURADOS
Biureto (ligações peptídicas 2 ou 3 aa)
Ninhidrina (grupos amina)
Sakagushi (guanidina da arginina)
Aminoácidos Sulfurados (cistina e cisteina)
Amostra 1 = solução de aminoácidos
hidrolisados
Amostra 2 = proteínas de grande
massa molecular e sem: arginina,
cistina e cisteina
Amostra 3 = Proteínas desconhecidas
de pequena massa molecular
- Folin 1 N (armazenado na geladeira)
- Reativo A - Solução de NaOH (hidróxido de sódio)
0,1 M com Na2CO3 (carbonato de sódio) 2%.
- Reativo B – Partes iguais de B1 (CuSO4 1%) e B2
(tartarato de Na e K 2%):
Dica: Armazenar o reagente B1 em frasco âmbar; e o
reagente B2 em frasco plástico.
- Pipetar as amostras em triplicatas nos tubos identificados,
adicionando em cada um 10 μL da amostra e 90 μL de água.
- Adicionar 1 mL do reativo C na curva e amostras em tubos.
- Homogeneizar os tubos no vórtex e após, deixar 10 minutos
em repouso.
- Adicionar 100 μL de Folin 1 N na curva e nas amostras.
- Homogeneizar os tubos no vórtex e manter em ambiente
escuro por 20 minutos (a cor é estável por até 2 horas).
- Realizar leitura em espectrofotômetro a 750 nm, em cubeta de
plástico, lavando-a com água destilada entre diferentes
amostras.
- Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml, e realizar curva
padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0,125 ug/ml; 0,25
ug/ml; 0,5 ug/ml; 0,75 ug/ml; e 1,0 ug/ml. Diluir BSA em tampão
de extração de proteínas. Aplicar 5ul de amostra de proteína na
placa.
- Após aplicar as amostras de proteína na placa, em triplicata,
adicionar 195 ul de reagente Bradford. Lembrar-se de aplicar o
branco, no caso o tampão de extração de proteínas (seguir mesma
mistura que as proteínas: 5 ul de tampão + 195 ul de reagente
Bradford).
- Incubar as amostras, sob leve agitação, por 5 minutos.
- Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595
nm em espectrofotômetro.
- Construir curva de padronização, com as concentrações de BSA na
abscissa e as absorbâncias médias na ordenada. Plotar no Excel,
obtendo equação de ajuste linear.
 Até semana que vem