Antibiograma: Interpretação e Preparo

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ANTIBIOGRAMA 
ANTIBIOGRAMA 
Objetivo: saber o que é o antibiograma-finalidade 
 saber como se prepara 
 saber interpretá-lo 
Conteúdo – sala de aula e laboratório 
Aula 14:00 – 17:00 
Técnica destinada à determinação da sensibilidade/resistência bacteriana 
in vitro frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de 
Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA). 
ANTIBIOGRAMA 
Interpretar a categoria de sensibilidade de acordo com os critérios 
estabelecidos CLSI (2011). 
Clinical and Laboratory Standards Institute 
Padronização do teste de sensibilidade 
CLSI - “Clinical and Laboratory Standards Institute” 
NCCLS - “National Committee for Clinical laboratory Standards” 
Finalidade: 
-Terapia antimicrobiana dirigida 
-Conhecer o fenótipo de sensibilidade de um microrganismo 
-Perfil epidemiológico 
 
Indicação do teste de sensibilidade: para qualquer organismo que: 
• contribua para o processo infeccioso 
• requer terapia antimicrobiana 
• sua sensibilidade não pode ser prevista quando do conhecimento da 
espécie envolvida 
• pertença a uma espécie capaz de exibir resistência aos antibióticos mais 
comumente empregados 
• Método da difusão 
• Diluição em caldo – micro e macrodiluição 
• Métodos automatizados 
• Outros 
Métodos de antibiograma 
Disco-Difusão 
Princípio: discos de papel de filtro com o antibiótico impregnado 
 
Finalidade: determinação qualitativa da sensibilidade 
Limitações 
• pH, espessura do meio 
• estabilidade dos discos 
– detecção de alguns mecanismos de resistência 
– análise qualitativa e não quantitativa 
– leitura e interpretação pelo usuário 
– necessita de um mínimo de 18 a 24 horas de incubação 
Aspectos relevantes: 
– fácil execução 
– flexibilidade 
– utilizado pela maioria dos laboratórios de microbiologia 
– menor custo 
– aplicado a microrganismos de crescimento rápido 
O teste de disco-difusão em ágar - Kirby e Bauer (1966) 
•Realização de um controle de qualidade: variáveis que podem afetar o teste de 
disco-difusão - destacam-se: 
 
 
- O preparo dos meios de cultura; 
- O controle do pH do meio; 
- O tempo; 
 - A temperatura e a atmosfera de incubação; 
- Concentração do inóculo; 
-O rigor na execução da técnica, etc. 
Vantagens do método de disco-difusão em ágar 
- A fácil execução; 
- A reprodutibilidade; 
- A utilização de reagentes de baixo custo; 
- Resultados de fácil interpretação clínica; 
-Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos 
- Não exigência de equipamentos especiais 
 Limitações: 
 
-Não padronização para algumas combinações de microrganismos e agentes 
antimicrobianos. 
 
-Pode não ser adequado para a detecção de mecanismos de resistência 
Müller-Hinton: 
- pH -7,2 a 7,4 
- Ca e Mg – interferem aminoglicosídeos e tetraciclinas – P. aeruginosa 
- Altura do ágar – 3 a 5mm 
- 24mm um do outro 
- Placas 150mm – 12 discos; 100mm - 5 discos 
Preparo do inóculo bacteriano 
Objetivo: turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland turbidímetro. 
- aproximadamente 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. 
-O inóculo bacteriano pode ser obtido por meio do método: 
-1) crescimento 
-2) suspensão direta da colônia 
1 Método de crescimento: transferir 3 a 4 colônias - mesma morfologia para 3 a 4 mL de 
caldo de Trypticase Soy Broth (TSB), solução fisiológica a 0,9%, ou caldo de Müeller-
Hinton . * 35±2 ºC até a turbidez atingir 0,5 da escala de McFarland: geralmente ocorre 
após 2 a 6 horas 
2 Método da suspensão da colônia direta: transferir 3 a 4 colônias - mesma morfologia 
para 3 a 4 mL de caldo de TSB, solução fisiológica a 0,9%, ou caldo de Müeller-Hinton 
* comparar o inóculo com a escala 0,5 de McFarland; 
 
Inoculação da placa: 5 minutos à temperatura ambiente 
Cepas que apresentam hemólise, tomar cuidado para ler a inibição do crescimento e não a 
hemólise 
Técnica de Kirby e Bauer - é a mais utilizada: fácil execução, baixo custo e 
confiabilidade de seus resultados. 
 
Técnica de Kirby e Bauer – instruções seguidas rigorosamente: os resultados obtidos 
correspondam à realidade 
*discos impregnados com antimicrobianos: 
1 monodiscos (avulsos em frascos com 50 unidades) 
2 multidiscos (embalagens contendo 25 “estrelas” com 12 discos em cada). 
Fatores determinantes para realização do TSA: 
 - Material clínico – cuidado com a microbiota normal; 
-Realização da técnica – passos seguidos rigorosamente conforme prescrito; 
-Escolha dos antimicrobianos – adequada 
-Pesquisa e confirmação de mecanismos de resistência. 
 
-Atualização: 
- grupos de antimicrobianos - grupo de microrganismo e de seus halos de interpretação 
(atualizações anuais das organizações internacionais) 
AMOSTRA 
Tipo de amostra: colônias puras de bactérias gram-positivas ou gram-negativas - 18 a 24 h 
Armazenamento e estabilidade: 
- Viáveis para a execução das análises até cerca de 24 horas em meio não seletivo. 
- Além deste prazo - novo repique da cepa - cultivar por mais 24 horas em meio não 
seletivo para depois proceder ao exame. 
Critério para rejeição: 
- As amostras que já ultrapassaram o prazo máximo de estabilidade devem ser rejeitadas 
para a análise, devendo ser repicadas em meio apropriado, e usadas colônias recentes. 
- Verificar a pureza do inóculo, e na dúvida, sugere-se o repique da cepa. Em caso de 
contaminação, deve-se reisolar o microrganismo a ser testado para evitar erros na 
medição dos halos. 
-Princípio da técnica 
- Suspensão de bactérias de cultivo recente 
-Inoculação suspensão - ágar Müeller Hinton 
- Aplicação discos de papel impregnados com antimicrobianos. 
- Incubação em estufa 
- Padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco 
- Medir o tamanho de cada halo 
- Resultado pesquisado em tabelas apropriadas segundo a espécie bacteriana em análise. 
1 Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvação 
compatível com o grau 0,5 da escala McFarland (1x106 UFC/mL) 
2 Embeber um suab estéril na suspensão bacteriana 
3 Semear em seguida de forma 
4 Aguardar - superfície do ágar secar 
5 Colocar os monodiscos ou multidiscos 
6 Incubar a placa 
7 Resultados: medir diâmetro dos halos inibitórios do disco, e consultar tabela 
apropriada: sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado 
Armazenamento e estabilidade: 
- Geladeira (2-8 °C) ou freezer (abaixo de -10 °C) - não ocorrendo contaminação 
microbiana ou umidificação, o produto se manterá estável até a data de validade 
expressa em rótulo. 
Reagentes: 
 
- Discos de papel impregnados com antibióticos - concentração padronizada. 
- Abertura precoce do frasco - condensação de água - aumento da umidade e 
consequente inativação do antibiótico com queda em sua atividade. 
- Seguir padronização técnica para execução da prova (CLSI, 2011). 
Cuidados 
- Observar critérios para escolha dos antibióticos apropriados para a bactéria em análise e 
suas resistências intrínsecas. 
-Discos e meios à temperatura ambiente antes do uso 
-Swabs com base de algodão e haste de madeira não recomendados 
- O meio de Müeller Hinton - deve estar com pH, composição química e espessura do 
ágar adequados. 
A temperatura de incubação deve ser rigorosamente controlada 
O tempo de incubação indicado não deve ser nem abreviado nem aumentado, sob risco de 
se obterem resultados falsamente diminuídos (pouco tempo) ou falsamente aumentados 
(mais tempo). 
Placas 90x15 mm - no máximo 5 discos; placa 140x15 mm -colocados até 12 discos. 
* Visa impedir que o contato entre os antimicrobianos difundidos no meio, - podendo 
fornecer distorções ligadas a sinergismo ou outros tipos de interação. 
- Meios espessura média de 4 mm - 3 mm a 5 mm 
- Inóculos acima do padrão 0,5 da escala McFarland - resultados falsamente 
diminuídos e inóculos mais fracos resultados falsamente aumentados; 
-Pré-incubação - 5 minutos após a inoculação: remover o excesso de umidade, que 
pode causar a difusão errada do antibiótico após a distribuição dos discos 
Principais fatores de erro na técnica: 
 
1 Erro na transcrição de dados 
2 Erro na leitura dos halos de inibição 
3 Erro na padronização do inóculo 
4 Contaminação ou alteração na cepa-controle (ensaio qualitativo de controle de 
qualidade) 
5 Padrão velho da escala de McFarland (suspensão de sulfato de bário) 
 6 Temperatura ou atmosfera impróprias para incubação 
7 Semeadura não homogênea no ágar 
8 Variações no desempenho do meio de cultivo 
9 Perda de potência do disco durante o armazenamento (excesso de umidade, 
temperatura inadequada, expiração do prazo de validade). 
 10 O pH, a composição química, a qualidade e a espessura do meio 
Detectar resistência é mais importante do ponto de vista clínico, porque pode se 
saber assim a probabilidade de êxito terapêutico. Por outro lado, a sensibilidade 
de um microrganismo diante de um agente antimicrobiano não é certeza 
absoluta de sucesso no tratamento, pois as reações in vivo podem ser diferentes 
das que ocorrem in vitro. 
Alguns microrganismos são reconhecidamente suscetíveis a certos agentes 
antimicrobianos e o tratamento empírico é largamente utilizado. 
Quando se sabe que o microrganismo é sensível a determinado antimicrobiano 
é desnecessário o teste de sensibilidade. A exceção é quando o paciente é 
alérgico a este antimicrobiano 
Quando realizar? 
Leitura interpretada 
Interpretação do antibiograma: 
 
• Classificação em resistente, intermediário e sensível 
 
• Tradução dos halos ou CIM 
 
• Estabelece probabilidade de sucesso ou fracasso terapêutico 
 
• Os critérios utilizados são gerados em função do conhecimento microbiológico, 
de dados farmacológicos e da resposta terapêutica 
Aspectos clínicos do antibiograma 
• Testes de rotina nem sempre predizem eficácia clínica 
 
• Microrganismos podem apresentar sensibilidade “in vitro” mas a resposta clínica ao 
tratamento é falha