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1 Métodos não instrumentais e instrumentais de análise de lipídios dos alimentos Bromatologia Prof. Dr.ª Janaina Vieira Lipídeos - Definição São compostos encontrados nos organismos vivos, geralmente insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos. São moléculas compostas por carbono, hidrogênio e oxigênio. Lipídeos - Classificação •Lipídeos simples; • Lipídeos complexos; • Lipídeos derivados. Lipídeos Simples Triacilglicerol C O CH O C O H H H H R1 O C R2 O C R3 O C - Ésteres de ácidos graxos com álcoois - Ésteres de ácidos graxos com glicerol = triglicerídeos, diglicerídeos, etc. - Ésteres de ácidos graxos com álcoois de cadeia longa = palmitato de cetila, ésteres das vitaminas A e D, etc. RC O Grupo acila Lipídeos Simples + H O C O R1 H O C O R1 H O C O R1 C O CH O C O H H H H H H H H + C O CH O C O H H H H R1 O C R2 O C R3 O C + 3 H O H Glicerol Ácido carboxílico Triacilglicerol (óleo ou gordura) água + + Óleos: TAG líquidos à temperatura ambiente; Gorduras: TAG sólidos à temperatura ambiente. Lipídeos Complexos - Além do éster AG/álcool possuem outros grupos na molécula; - Fosfolipídios ésteres do glicerol com ácidos graxos e com ácido fosfórico ligado a aminas (fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol) - Cerebrósidos Ácidos graxos, um carboidrato e um composto nitrogenado (galactocerebrósido, glucocerebrósido) - Esfingolipídios Ácidos graxos, composto nitrogenado e grupo fosforila (esfingomielina). Lipídeos Complexos Fosfolipídeos R1 C O O CH2 CHO O CR2 R3O O - O POH2C onde, R1 e R2 são cadeias alquílicas longas 2 Lipídeos Derivados Substâncias derivadas de lipídeos neutros ou compostos com propriedades dos lipídeos (ácidos graxos, álcoois de cadeia longa, esteróis, vitaminas lipossolúveis e hidrocarbonetos). CH3 CH3 CH H CH3 CH2 CH3 CH3 CHCH2 CH2 A B C D1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 CH3 CH3 CH H CH3 CH2 C CH2 O W A B C D1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 NHCH2COO - Na + OHW= W= (ácido cólico = ácido bile) (glicolato de sódio = sal de bile) Colesterol Forma nos alimentos • Óleos e gorduras • Glicerídeos (acilgliceróis): MONO, DI E TRIGLICERÍDIOS ÉSTERES DE ÁCIDO GRAXO E GLICEROL Todas as gorduras comestíveis são triglicérides • É um álcool de cadeia pequena com 3 átomos de C unidos com 5 átomos de H e 3 hidroxilas Glicerol Classificação AG • Comprimento da cadeia (4 - 36 átomos de C) Quanto maior o comprimento maior a insolubilidade • Ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) • Possuem até 6 átomos de Carbono • Ácidos graxos de cadeia média (AGCM) • Possuem de 8 a 12 átomos de C • Ácidos graxos de cadeia longa (AGCL) • Possuem de 14 a 18 átomos de C • Ácidos graxos de cadeia muito longa (AGML) • Possuem 18 ou mais átomos de C Ácidos graxos • Saturados • Apenas ligações simples entre os átomos de C (ácido araquídico, láurico, palmítico • Insaturados • Contém ligações duplas entre os átomos de C. Ácido linoléico, oléico,araquidônico, palmitoléico • MONOINSATURADO: 1 ligação dupla • POLIINSATURADOS: muitas ligações duplas entre os átomos de C (pufa´s) Função dos lipídios nos alimentos • Amaciante • Agente ligante • Aeração • Estrutura da emulsão • Textura dos alimentos • Flavor • Transferência de calor 3 Degradação térmica dos lipídios TRIGLICERÍDEOS Ácidos graxos e glicerol Diversos compostos de degradação Ex.: ACROLEÍNA (substância volátil e irritante da mucosa gástrica) calor + calor Altas temmperaturas Decomposição química • Cada gordura tem o seu ponto de fumaça • Para frituras, devem ser escolhidas as que tiverem maior ponto de fumaça Ponto de fumaça • Deve ser uma gordura hidrogenada para suportar calor (170°C a 200°C) • Deve estar na forma de triglicerídios • Menor presença de PUFA´s ou conter no máximo 2% de omega-3 • Conter antioxidantes (vitamina E) • Não conter ácidos graxos livres Gorduras para frituras • AG insaturados são menos resistentes à oxidação. • Alimentos ricos em lipídios expostos ao O2 do ar → degradação por quebra oxidativa das duplas ligações TCC + volatilidade (odor rançoso) Rancidez • Ranço: odor e sabor desagradáveis quando permanecem ao ar em temperatura ambiente por um certo período • Hidrólise e oxidação catalisados por microrganismos do ar, produzindo ácidos graxos e glicerol a partir da gordura e óleo presente na manteiga, por exemplo • Oxigênio presente no ar oxida algumas insaturações Rancidez • Ranço: odor e sabor desagradáveis quando permanecem ao ar em temperatura ambiente por um certo período • Hidrólise e oxidação catalisados por microrganismos do ar, produzindo ácidos graxos e glicerol a partir da gordura e óleo presente na manteiga, por exemplo • Oxigênio presente no ar oxida algumas insaturações Rancidez 4 • Causas: • Combinação dos ácidos graxos com o oxigênio do ar (rancificação oxidativa) • Degradação da gordura por enzimas, liberando ácidos graxos voláteis (rancificação enzimática ou hidrolítica) • Antioxidantes • Substâncias que impedem a rancificação lipídica (butilhidroxianisol – BHA e butilhidroxitolueno – BHT) Rancidez • Conservar em ambiente frio • Vasilhames para armazenamento limpos e opacos para evitar a exposição a luz • Para fritura de imersão, usar recipientes fundos e estreitos • Não reaproveitar diversas vezes Conservação das gorduras Importância da análise de Lipídeos nos alimentos • Rotulação nutricional (saturação, colesterol, calorias); • Padrões de identidade e qualidade; • Compreensão das propriedades funcionais do alimento. Métodos • Métodos rotineiros baseiam-se na extração da fração lipídica: Por meio de solvente orgânico adequado; Por extração úmida sem solventes orgânicos; Por extração mecânica; Pelo uso de fluidos supercríticos. • Solventes orgânicos extraem lipídios neutros (ácidos graxos livres, triglicerídios) e alguns polares (fosfolipídios, etc). Extração a quente Etapas: Extração do lipídio do alimento com solvente; Eliminação do solvente por evaporação; Quantificação do lipídio por pesagem. Características Escolha do solvente depende dos componentes. A extração é mais eficiente após secagem da amostra. 5 Extração a quente Preparo da amostra: Evitar oxidação Produtos ricos em proteínas e carboidratos devem ser submetidos a hidrólise ácida antes da extração. É necessário controlar o tempo/temperatura de exposição da amostra; Equipamento: Soxhlet (sistema semi-contínuo) Utiliza refluxo do solvente Extração intermitente Utilizado para amostras sólidas Extração a quente Limitação Somente para amostras sólidas Eficiência da extração Natureza do material a ser extraído; Tamanho das partículas; Umidade da amostra; Velocidade do refluxo; Quantidade relativa da amostra e solvente; Natureza do solvente. Tipos de solvente Éter etílico. Éter de petróleo. Equipamento: Goldfish (sistema contínuo) mais eficiente. Método modificado : hidrólise ácida antes da extração com solvente. Cálculo para a extração a quente 100 x N = lipídios ou extrato etéreo % P N = nº de gramas de lipídios P = nº de gramas da amostra Extração a frio: Método BLIGH-DYER Extração a frio a partir de três solventes: clorofórmio-metanol- água. Vantagens: Extrai todas as classes de lipídios, inclusive os polares. Extração sem aquecimento: pode ser utilizado para avaliar o grau de deterioração de um óleo ou gordura, teor de carotenóides, vitaminas e composição de ácidos graxos em geral. Pode ser utilizado também em produtos com altos teores de umidade. Não necessita de equipamento específico. Extração a frio: Método BLIGH-DYER Procedimento Pesar a amostra; 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água (1:2:0,8) nesta proporção os solventes coexistem em uma solução homogênea; Agitação por 30 minutos; 10 mL de clorofórmio e 10 mL de água; Agitação por 2 minutos; (2:2:1,8) separação do clorofórmio da solução que carrega os lipídios (camada inferior). 6 Extração por hidrólise ácida: Processo de Gerber Utilizado para leites e derivados; A gordura está presente na forma de emulsão de óleo em água, encapsulada por proteína; Tratamento da amostra com ácido sulfúrico; Álcool isoamílico: facilita a separação da gordura e reduz o efeito da carbonização; Ácido sulfúrico deve ter densidade de 1,82; Leitura direta a aproximadamente 65 oC. Extração por hidrólise ácida: Processo de Gerber Procedimento Transferir para butirômetro 10 mL de H2SO4 (d20 = 1,82 g/L); Adicionar o leite (11 mL); Adicionar álcool isoamílico; Agitar vigorosamente (envolto em toalha) Centrifugar por 4-5 minutos a 1200-1400 rpm; Deixar em banho-maria por 3 minutos (65 oC); Fazer leitura do volume diretamente no butirômetro. Extração por hidrólise ácida: Processo de Gerber Método de Babcock Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de amostra e ácido sulfúricos adicionados, e na adição de água quente em vez álcool isoamílico. O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que o de Babcock. Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier A amostra é tratada com hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação proteína-gordura, e a gordura separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico; O álcool precipita a proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída com éter; A extração com éter é muito eficiente em amostras com muito açúcar como, por exemplo, leite condensado. Outros métodos (instrumentais) • Absorção de Raios X (gordura na carne); • Método infravermelho; • Condutividade elétrica (Método dielétrico). 7 Método qualitativo Teste Sudan IV • O reagente químico Sudan IV é apolar; • Adicionado à uma solução contendo a amostra e etanol, a fim de dissolver qualquer tipo de lipídeo; • Se o resultado for positivo, haverá formação de coloração alaranjada. Qualificação dos lipídeos • Determinar o perfil lipídico Cromatografia • Determinar o “estado” do lipídeo (grau de deterioração) • Caracterização geral lipídica. Análises Análise da fração lipídica do alimento Caracterização de lipídeos Caracterização de lipídeos Índice de iodo • Medida do grau de insaturação dos lipídeos; • Sob determinadas condições, o iodo pode ser quantitativamente introduzido nas duplas ligações dos ácidos graxos insaturados e triglicerídeos; • Gramas de iodo absorvidas por 100g de amostra; • Quanto maior a insaturação, maior a capacidade de absorver iodo; C C I2 C C I I + (Lugol) Caracterização de lipídeos Índice de iodo •Método de Wijs usa ICl (monocloreto de iodo) Índice de iodo: (A – B) x f x 1,27/ P A- volume de solução de tiossulfato de sódio 0,1 N gasto na titulação da amostra B- volume de solução de tiossulfato de sódio 0,1 N gasto na titulação do branco f – fator da solução de tiossulfato de sódio 0,1N P – peso da amostra •Método de Hanus usa IBr (monobrometo de iodo); •Aplicação = monitoramento hidrogenação de óleos, grau de insaturação e oxidação lipídica. Índice de saponificação Lipídios neutros glicerol + ácidos graxos (tratamento com álcali) IS = mg de KOH necessários para saponificar 1g de gordura Indicador do peso molecular médio dos triglicerídios na amostra Dividindo por 3 leva ao PM aproximado dos ácidos graxos presentes + C O CH O C O H H H H H H H C O CH O C O H H H H R1 O C R2 O C R3 O C Glicerol Sais de sódio dos Ácidos carboxílicos SABÃO Triacilglicerol (óleo ou gordura) + 3 H O H água Na + OH - + + O - Na + C O R3 O - Na + C O R2 O - Na + C O R1 Ácidos graxos livres Acidez da gordura ácidos graxos livres (hidrolisados do triglicerídeos); A decomposição dos glicerídeos é acelerada por aquecimento e pela luz, e a rancidez é quase sempre acompanhada pela formação de AGL; Fosfatos ácidos e aminoácidos podem contribuir para acidez; IA = mg de KOH necessários para neutralizar AGL em 1g de gordura Uso para verificar refinamento dos óleos. 8 Índice do ácido tiobarbitúrico (TBA) Mede produtos secundários da oxidação (malonaldeído); ITBA = mg Malonaldeído /Kg de amostra; Reação com TBA após destilação.; Correlaciona melhor com avaliação sensorial da rancidez de alimentos. Índice de peróxido • Relacionado ao grau de oxidação lipídica; •IP = meq. de peróxidos/kg de gordura; • Determina todas as substâncias que oxidam o iodeto de potássio; •KI + Peróxidos I2 Em seguida: I2 + amido (azul) + Na2SO3 NaI (incolor); •Baixos valores de IP = fase inicial ou de término. Índice de peróxido= (A – B) x N x f x 1000/P A- volume da solução titulante gasta para a amostra; B- volume da solução titulante para o branco; N- normalidade da solução titulante; P- peso da amostra; f- fator de correção da solução de tiossulfato de sódio 0,1N Índice de refração • Os lipídeos possuem diferentes índices de refração; • Análise realizada a 40oC; • O índice de refração aumenta com o comprimento da cadeia hidrocarbonada e com o grau de insaturação dos ácidos graxos; Determinação do índice de Polenske • Volume de solução de NaOH 0,1N necessário para neutralizar os ácidos voláteis insolúveis em água (caprílico, cáprico, láurico e mirístico). Determinação do índice de Bellier • Diferencia gorduras de sementes e películas de frutas; • Utilizado como controle de firmeza de óleos de oliva; • Utilizado também para detecção de óleos vegetais em gorduras animais. Determinação de fósforo • Definido como o teor de fosfomolibdato determinado colorimetricamente; • Uma conversão para fosfatídeos com o auxílio de um fator correspondente é possível; • A amostra é incinerada e o teor de fósforo das cinzas é determinado colorimetricamente após conversão para fosfomolibdato. 9 Índice de anisidina • Medida da concentração de aldeídos saturados presentes em óleos e gorduras; • Aplicado a óleos e gorduras animais e vegetais brutos ou refinados. Determinação de óleo neutro • Determina o óleo neutro em óleos e gorduras, que é constituído essencialmente de triglicer;ideos e de matéria insaponificável; • Os AGL e várias substâncias não gordurosas são removidas por adsorção em uma coluna de alumina ativada. Densidade • Expressa em gramas/cm3; • Densidade relativa é a relação entre a massa de uma substância e a massa de igual volume de água a 4oC; • Quanto maior o grau de insaturação menor a densidade; • As gorduras são mais densas no estado sólido do que no estado líquido. Solubilidade • Propriedades de dissolução de óleos e gorduras em solventes específicos; • Depende da natureza e quantidade dos ác. Graxos, do solvente e da temperatura. Ponto de fusão • Os triglicerídeos puros apresentam ponto de pusão nitidamente definido; • As gorduras naturais e processadas, fundem-se commudança de temperatura; • Ponto de fusão: temperatura na qual o último traço sólido se funde (temperatura na qual se fundem os triglicerídeos de maior ponto de fusão). Ranço incipiente – Prova de Stamm • Formação de uma coloração vermelha no ensaio indica que a amostra se rancificará em breve, ainda que as características sensoriais estejam perfeitas; • Nesse teste, utiliza-se solução de difenilcarbozida. 10 Considerações finais - Mediante a determinação de lipídeos é possível avaliar características nutricionais e tecnológicas nos alimentos analisados. -Os métodos de determinação de lipídeos estão baseados principalmente no que diz respeito à solubilidade destes compostos. -Dependendo do método e dos procedimentos aplicados as determinações poderão ser quantitativas ou qualitativas. Referências Bibliográficas • Morreto, E; Fett, R. Tecnologia de óleos e gorduras vegetais na indústria de alimentos. Livraria Varela, São Paulo, 1998. 150p. •CECCHI Heloísa Máscia; Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. São Paulo; Editora Unicamp; 2007. • INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas, métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IAL, 1985, v.1, 371p.
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