Aula Prática Diagnóstico de Salmonella em alimentos e pato aviaria - 22-10-20

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Aula Prática
Diagnóstico de Salmonella
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA – (FAMV)
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOEXPERIMENTAÇÃO
Médica Veterinária Mestranda Adriana Souto Pereira Núncio
Orientadora: Profª Dra. Laura Beatriz Rodrigues
Passo Fundo, 22 de outubro de 2020.
Diagnóstico de Salmonella
Alimentos
Salmonella
CLASSIFICAÇÃO
• Bacilo Gram negativo;
• Não esporogênicos;
• Aeróbios e anaeróbios facultativos;
• Maioria dos sorovares são móveis; 
• Crescimento: 37C;
• Mesófilas (25C e 40C);
• Aw: 0,94;
• Suscetíveis à destruição pelo calor: 55°C/1h ou 60°C/20 min.
GÊNERO: Salmonella
➢ Espécies: 
✓ Salmonella bongori
✓ Salmonella enterica subespécie
Comumente denomina-se: Salmonella Heidelberg
(Forsythe 2002; Grimont &Weil, 2007)
ESPÉCIE SUBESPÉCIE SOROVAR
Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Heidelberg
enterica
salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
➢Subespécies divididas em sorovares:
Em 2016: 2.637 SOROVARES
(LOPES et al., 2016)
Resolução RDC n° 12 - 2001 
Qualidade 
microbiológica
Critérios e padrões 
microbiológicos 
para alimentos
Alimentos 
destinados ao 
consumo humano
DTA
Salmonella →
PRESENÇA/AUSÊNCIA EM 25 g/ml
-Frutas, produtos de frutas e similares;
-Hortaliças, legumes e similares, incluindo cogumelos (fungos 
comestíveis);
-Raízes, tubérculos e similares;
-Carnes e produtos cárneos;
-Ovos e derivados;
-Pescados e produtos de pesca;
-Leite de bovinos e de outros mamíferos e derivados;
-Produtos lácteos;
-Cereais;
GRUPO DE ALIMENTOS PARA PESQUISA DE Salmonella
Resolução RDC n° 12 - 2001 
RDC 12 não contempla 
pesquisa de Salmonella
em carne de frango.
ISO 6579:2002 
Isolamento Bacteriano
ISO 6579:2002 
→ Aplica-se a todos os alimentos destinados ao consumo humano, às rações 
animais e a amostras do ambiente de fabricação ou manipulação de alimentos. 
1º: Pesagem e preparo da amostra:
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra, em sacos estéreis.
ESTUFA 
41-43°C/21 a 27h
2º Pré-enriquecimento 
caldo não seletivo
3º Enriquecimento 
Seletivo
TT RP
BPLS XLD BPLS XLD
Isolamento Bacteriano
Muller-
Kauffmann
Tetrationato
com 
novobiocina
ESTUFA
36°C (+/-1)/16 a 20h
225 mL Água Peptonada 1% 
(1:10)
9mL TT 9,9mL RP
1mL 0,1mL 
Contra prova
C- e C+
4º plaqueamento 
seletivo diferencial
Homogeneizar 60 s no "stomacher" 
Incubar as placas invertidas, a 37 ± 1°C /24 ± 3 horas 
FOTO 
ALIMENT
O
Após o período de incubação verificar se há desenvolvimento de colônias
típicas de Salmonella nos meios de plaqueamento diferencial.
5º Seleção
XLD BPLS
PROVAS BIOQUÍMICAS
ESTUFA
36°C (+/-1)/18 a 24h
VP
CARACTERIZAÇÃO 
ANTIGÊNICA (Vi, H e O) 
Poli “O”, Poli “B” (H:i, H:2 H:r), 
Poli “D” (Hgm, Hgp, Hm, Hp)
AN
6º Confirmação
TSI UREIA LISINA
β-Galactosidase
SIM
Reagente 
Kovacs →
TESTE INDOL
Para teste indol pode usar 
triptona com triptofano.
BAX System®
Método por PCR 
Método validado e aceito pela AOAC.
→Sistema rápido de detecção de patógenos;
→Utiliza a tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
→Detecta 100% de sorovares de Salmonella em alimentos;
→Método de triagem!!!!
→Resultados positivos devem ser confirmados por método convencional.
Pré-enriquecimento
Água Peptonada Tamponada (APT)
▪ Meio não seletivo para a fase de pré-enriquecimento no processo de isolamento de
Salmonella em alimentos e água para aumentar a recuperação destes microrganismos;
▪ A triptona fornece aminoácidos e proteínas;
▪ O cloreto de sódio mantém o balanço osmótico do meio;
▪ O fosfato dissódico e o fosfato monopotássico são agentes tamponantes.
Pré-enriquecimento
Água Peptonada 1%
Enriquecimento Seletivo
Tetrationato - TT
▪ A adição da iodo-iodetato mais o tiossulfato inibem o crescimento de coliformes e
proporciona um ambiente ideal para as bactérias redutoras de tetrationato como Salmonella
e Proteus podendo se multiplicar com mais facilidade. Os sais biliares inibem o
desenvolvimento de microrganismos Gram positivos.
novobiocina
ESTUFA
36°C (+/-1)/18 a 24h
9mL TT 10mL RP
1mL 0,1mL 
Rappaport Vassiliadis - RV
▪ Possui verde de malaquita em sua composição e a Novobiocina é adicionada como um 
agente seletivo.
ESTUFA
36°C (+/-1)/18 a 24h
9mL TT 10mL RP
1mL 0,1mL 
Provas Bioquímicas
TSI (Triple Sugar Iron Agar)
▪ Açucares:
➢ Fermentação da Glicose: reação ácida no fundo do tubo (amarelo) reação alcalina na superfície 
(vermelho); → Salmonella fermenta glicose (+) base amarela (reação ácida).
➢ Fermentação da glicose, sacarose e lactose: reação ácida em todo o meio, formando coloração 
amarela no fundo e na superfície; → Salmonella incapaz de
metabolizar a lactose e a sacarose (-): reação alcalina. 
▪ Produção de gás: 
➢ Formação de bolhas de gás no meio;
▪ Produção de H2S: 
➢ Fundo do tubo torna-se enegrecido (escuro);
➢ Determina se houve a liberação de H2S de aminoácidos 
do meio de cultura, por ação de uma enzima (cisteína desulfidrase);
BIOQUÍMICA PRELIMINARConfirmação
LIA
▪ Avalia-se a descarboxilação da lisina, desaminação da lisina e produção de H2S;
▪ Salmonella: + cor púrpura. Reação Alcalina.
▪ Contem:
▪ Lisina (aminoácido);
▪ Glicose (carboidrato);
▪ Proteína (pouco);
▪ Violeta de bromocresol (indicador de pH);
▪ Tiossulfato de sódio/ citrato de amônio férrico 
(fonte de enxofre e indicador de H2S).
BIOQUÍMICA PRELIMINAR
Confirmação
SIM (gás sulfídrico, indol, motilidade)
▪ H2S ( Salmonella +)
▪ Motilidade: (Salmonella +)
▪ É observado em no meio SIM através da inoculação com agulha, deixando 1 cm do meio sem
perfuração. O crescimento de microrganismos imóveis fica restrito ao local da inoculação. No caso
das móveis a bactéria migra pelo meio tornando-o turvo.
▪ Indol: (Salmonella -)
▪ Produto resultando da degradação do triptofano, detectado pelo reagente do Kovac’s
(composto aldeído).
BIOQUÍMICA PRELIMINARConfirmação
SIM (gás sulfídrico, indol, motilidade)
BIOQUÍMICA PRELIMINARConfirmação
URÉIA
▪ Capacidade da bactéria utilizar a ureia formando moléculas de amônia, através da enzima 
urease.
▪ Salmonella urease negativa;
BIOQUÍMICA PRELIMINARConfirmação
β - Galactosidase (ONPG)
▪Mostra a presença ou ausência da enzima beta galactosidase. 
▪Negativo para Salmonella.
VP Voges-Proskauer Test
▪ Habilidade de organismos em detectar a acetilmetilcarbinol.
▪Salmonella negativo.
Interpretação de 
Resultados - Alimentos
Comportamento Bioquímico
Preliminar
S. Typhimurium, S. Enteritidis e S. 
Heidelberg entre outras...
TSI
Base
Fermentação de Glicose
Reação Ácida
(+) Amarela
Gás Produção de gás (+)
Bisel
Utilização da Lactose e/ou Sacarose
Reação alcalina
(-) Vermelho
H2S Enegrecimento do meio (+)
LIA
Base/Bisel
Produção de Lisina Carboxilase
Reação Alcalina
(+) Púrpura
H2S Enegrecimento do meio (+)
SIM
Motilidade
Turvação do ágar na ausência de H2S ou 
enegrecimento na presença de H2S.
(+)
Indol Coloração do anel (-) Anel Amarelo
H2S Enegrecimento do meio (+)
Uréia Presença de Urease
(-) Inalterado
VP Ausência de acetoína (-) amarelo
beta- galactositase Presença ou Ausência da enzima (-) 
Lisina 
Descarboxilase
Realcalinização
Púrpura-Amarelo-Púrpura
(+) Púrpura
Diagnóstico de Salmonella
na Sanidade avícola 
Métodos de ensaio
Sorologia
Isolamento 
bacteriológico
Pré-enriquecimento
Isolamento
Bioquímico
Sorotipificação
O que espera de resultado?
Isolamento
Sorológico
indireto
Patógeno 
envolvido
Anticorpos
Sorologia
SAR – Sorologia rápida em placa 
Sorologia indireta
▪ COLHEITA DA AMOSTRA:
▪ Veia braquial (asa);
▪ Punção cardíaca (pintinhos).
▪ SANGUE TOTAL 
▪ SORO (AMOSTRA RESFRIADA)
Isolamento Bacteriano
DIAGNÓSTICO DEFINITIVO
ESTUFA 
42-43°C/18 a 24h
Pré-enriquecimento
Enriquecimento 
Seletivo TT RP
MC/VB XLD MC/VB XLD
Isolamento Bacteriano
Iodo 200uL
ESTUFA
36°C (+/-1)/18 a 24h
Água Peptonada 1% (1:10)
9mL TT 10mL RP
1mL 0,1mL 
Contra prova
BIOQUÍMICA PRELIMINAR
ESTUFA
36°C (+/-1)/18a 
24h
ESTUFA
36°C (+/-1)/18 a 24h
Citrato Fenil. Dulc. Malt. Glic. Man. Lac. Sac. Malon
ato
Lisina Arg. Ornit. VM VP
CARACTERIZAÇÃO 
ANTIGÊNICA
Poli “O”, Poli “B” (H:i, H:2 H:r), 
Poli “D” (Hgm, Hgp, Hm, Hp)
AN
Confirmação
Provas Bioquímicas
PROVAS BIOQUÍMICAS ADICIONAIS
Citrato de Simmons
▪ Bactérias capazes de utilizar citrato como única fonte de carbono.
→ Salmonella Pullorum e Gallinarum: (-) inalterado
→S. Typhimurium, S. Enteritidis e S. Heidelberg :(+) Azul
Lisina, Ornitina e Arginida
▪ Habilidade enzimática da bactéria para descarboxilar um aminoácido para formar amina, 
resultando em alcalinidade.
▪ Bactéria possui descarboxilase específicas capaz de atacar aminoácidos na ligação carboxila 
(-COOH), resultando em amina e CO2.
Ornitina descarboxilase: 
Gallinarum: (+) Púrpura
Pullorum: (-) 
Enteritidis...Etc (+) Púrpura
Malonato:
Alcalinização do meio:
Salmonella: (-) inalterado
Carboidratos
▪ Fermentação: 
➢ Sorbitol, Ramnose, Dulcitol, manitol, glicose, maltose, lactose:
Sorotipificação
▪ Polivalente “O”
▪ Polivalente “H”
Interpretação de 
Resultados - Sanidade
Comportamento Bioquímico
Preliminar
Salmonella
Pullorum
Salmonella
Gallinarum
S. Typhimurium, 
S. Enteritidis e S. 
Heydelberg entre 
outras
TSI
Base
Fermentação de Glicose
Reação Ácida
(+) Amarela (+) Amarela (+) Amarela
Gás Produção de gás (+/-) diferentes tipos (-) (+)
Bisel
Utilização da Lactose e/ou Sacarose
Reação alcalina
(-) Vermelho (-) Vermelho (-) Vermelho
H2S Enegrecimento do meio (+/-) (+) (+)
LIA
Base/Bisel
Produção de Lisina Carboxilase
Reação Alcalina
(+) Púrpura (+) Púrpura (+) Púrpura
H2S Enegrecimento do meio (+/-) (+) (+)
SIM
Motilidade
Turvação do ágar na ausência de H2S 
ou enegrecimento na presença de 
H2S.
(-) (-) (+)
Indol Coloração do anel (-) Anel Amarelo (-) Anel Amarelo (-) Anel Amarelo
H2S Enegrecimento do meio (+/-) (+) (+)
Uréia Presença de Urease (-) Inalterado (-) Inalterado (-) Inalterado
Comportamento Bioquímico
Complementar
Salmonella
Pullorum
Salmonella
Gallinarum
S. Typhimurium, S. 
Enteritidis e S. 
Heydelberg entre outras
Citrato de Simmons Alcalinização (-) Inalterado (-) Inalterado (+) Azul
Ornitina Descarboxilase
Realcalinização
Púrpura-Amarelo-Púrpura
(+) Púrpura (-) Amarelo (+) Púrpura
Maltose Reação Ácida
(-) Inalterado
ou tardiamente
(+) Amarelo
(+) Amarelo (+) Amarelo
Dulcitol Reação Ácida (-) Inalterado
(+) Amarelo
ou ocasionalmente
(-) Inalterado
(+) Amarelo
VM Reação ácida (+) vermelho (+) vermelho (+) vermelho
VP Ausência de acetoína (-) amarelo (-) amarelo (-) amarelo
Fenilalanina desaminase Ausência de ácido fenilpirúvico (-)inalterado (-) inalterado (-)inalterado
Lisina Descarboxilase
Realcalinização
Púrpura-Amarelo-Púrpura
(+) Púrpura (+) Purpura (+) Púrpura
Arginina desidrolase
Realcalinização
Púrpura-Amarelo-Púrpura
(-) amarela ou
(+) Púrpura
(-) amarela
(-) amarela ou
(+) Púrpura
Malonato Alcalinizalção (-) inalterado (-) inalterado (-) inalterado
D-Glicose produçãode
ácido
Reação ácida (+) Amarelo (+) Amarelo (+) Amarelo
D-Glicose produção de gás Reação ácida
(-) sem bolhas ou
(+) presença de bolhas
(-) sem bolhas (+) presença de bolhas
Lactose Reação ácida (-) inalterado (-) inalterado (-) inalterado
Sacarose Reação ácida (-) inalterado (-) inalterado (-) inalterado
D – Manitol Reação ácida (+) Amarelo (+) Amarelo (+) Amarelo
Caracterização antigênica da Salmonella
Typhimurium
Antissoros Resultado da aglutinação Interpretação
“B” (4,5) + Confirmação do grupo
H:i + Confirmação da presença do fator H:i
H:2 + Confirmação da presença do fator H:2
Diferenciação bioquímica de S. Pullorum
e S. Gallinarum
Provas bioquímicas Salmonella Pullorum Salmonella Gallinarum
Descaboxilação da ornitina + -
TSI
Produção de H2S +/- +
Fermentação da Glicose + +
Produção de gás +/- -
Fermentação do dulcitol - +/- (ocasionalmente 
negativa)
Fermentação da maltose
-/+ (ou tardiamente 
positiva)
+
IN 78 /2003 PNSA
Certificado como livre de Salmonella Gallinarum (tifo aviário) e Salmonella Pullorum (pulorose) e livre
ou controlado para Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium.
→Linhas puras, bisavoseiros e avoseiros deverão apresentar-se livres das quatro salmonelas:
Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium
→Matrizeiros deverão ter a condição de livres de Salmonella Gallinarum e Salmonella Pullorum e
livres e/ou controlados para Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium.
Avós: Positividade para Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, Salmonella Enteritidis e
Salmonella Typhimurium→
sacrifício/abate do núcleo e eliminação de todos os ovos, incubados ou não, provenientes dos
núcleos afetados.
Matrizes: positividade para Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum →
sacrifício/abate do núcleo e eliminação de todos os ovos, incubados ou não, dele provenientes.
IN 20 /2016
FRANGO DE CORTE:
- Salmonella sem implicação em saúde pública: Gallinarum e Pullorum.
→ Abate normalmente, mas posteriormente higienização do frigorifico.
- Salmonella com implicação em saúde pública: Enteritidis, Typhimurium...
→ Idem anterior, porém deve-se destinar o produto para CMS, tratamento 
térmico ou outro tratamento aprovado pelo ministério que garanta eliminação 
do patógeno.
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA – (FAMV)
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOEXPERIMENTAÇÃO
Adriana Souto Pereira Núncio
adrianaspn@hotmail.com