ok controle pratica 25.08.11

Prévia do material em texto

Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
25/08/2011 - Prática 11:20 à 13:00 horas
Recepção das amostras
Minha amostra vai chegar ao laboratório, a pessoa que vai recepcionar , vai verificar se as informações estão completas, como procedência do alimento, como foi coletado o horário, quem coletou, se foi respeitado o prazo entre a coleta e a entrega da amostra ao laboratório. A amostra deve chegar até 24h após a coleta ao laboratório, com exceção das amostras de moluscos, crustáceos e ovo líquido.
As pessoas que forem recepcionar essas amostram vão direcionar quais são as amostras que possuem prioridade, como assim: essa pessoa vai direcionar se é uma amostra para análise fiscal, se é uma amostra da analise de rotina, etc. porque quando essa amostra é uma análise fiscal suspeita de alguma surto essa amostra vai ter prioridade perante as amostras que são de analise de rotina. 
A pessoa que faz a recepção das amostras vai encaminhar para a parte do laboratório de controle microbiológico. No momento da analise microbiológica necessito utilizar materiais estéreis para não contaminar a minha amostra. Minha embalagem vai ser aberta ou próxima ao bico de bulsin ( que é próxima a chama do fogo porque é uma área de segurança microbiológica) ou dentro de uma capela (de uma câmara com fluxo laminar) antes de ser aberta, a embalagem sofrera limpeza com álcool a 70%.Vou limpar essa embalagem com álcool e depois disso vou abrir.
No caso de latas, conservas, leite condensado,antes de abrir a lata, vou lavar essa lata com água e sabão. Depois que eu lavei com água e sabão eu vou passar um álcool nessa lata para que eu possa abrir.
Abertura das amostras:
Dentro de uma câmara de fluxo laminar ou próxima ao bico de bilsen.
Minhas amostras sempre devem ser homogeneizadas para garantir a distribuição uniforme da carga microbiana. No caso das amostras heterogêneas eu devo pegar diversas partes da amostra, ex: bolo da carne, eu tenho varias camadas, com isso eu preciso que minha amostra tenha varias camadas, com isso eu coleto uma fatia do meio do bolo de carne, uma fatia das pontas. Para verificar a contaminação.
No caso de alimentos congelados: eu devo extrair essa amostra do alimento congelado com o alimento ainda congelado, porém as vezes fica inviável porque eu preciso utilizar uma broca estéril e as vezes não dispomos disso ou não temos força para isso, ai o que fazemos: ou fazemos o descongelamento lento (coloco alimento na geladeira e espero ele descongelar), ou utilizo um Banho Maria, ate meu alimento descongelar.
Uma coisa importante, é que durante esse processo de descongelamento eu preciso monitorar se minha temperatura não está acima de 5ºC, porque a cima de 5ºC eu vou começar a ter multiplicação microbiana muito significativa, e com isso meu resultado microbiológico não vai refletir a minha realidade, porque se não mantenho o alimento em condições adequadas, no momento que coletei tem uma carga x, e na hora que eu for analisar, vai ter uma carga microbiana 2x. 
Foto slide: Capela de fluxo laminar possui uma luz UV onde vamos realizar tudo aqui dentro, e essa luz UV faz com que essa capela se torne estéril, antes de começar a análise eu vou ligar essa lâmpada ultra violeta, primeiro limpo a bancada com álcool, depois ligo a luz UV, e deixo ligada por uns 15-20 minutos. Quando eu for trabalhar eu apago essa luz para não queimar, aí ligo a luz normal. Essa capela possui um sistema de renovação de ar controlado, existe um filtro de purificação do ar, não ocorre contaminação quando se trabalha aqui dentro.
Quando não tenho essa capela no laboratório, vou usar o bico de bilsen, vou trabalhar sempre ali perto, o grande problema é que com o bico você precisa ter muito mais cuidado e já na capela vc trabalha mais tranquilamente. 
As análises vão ser aqui dentro atrás do vidro, onde a pessoa deve estar paramentada. 
Se estiver trabalhando com algum patógeno, deve ser utilizado o óculos (obrigatoriamente) . 
E quando estou trabalhando com o bico de bulsin vou usar o oculos obrigatoriamente porque não tem a proteção do vidro, e não uso luva porque queima. 
Quando eu trabalho com o bico de bulsen, não vou utilizar a luva por conta do fogo. Se cair alguma gota na sua mão, vc lava na hora, com água destilada e sabão, que não vai acontecer nada.
Toda vez que entrar no laboratório, deve lavar a mão e trocar a roupa para evitar possíveis contaminações do ambiente.
Amostra de molucos
Quando estou trabalhando com amostras de moluscos, antes de abrir para analise, eu devo lavar a casca do molusco com água e sabão. Vou lavar essa casca, vou esperar secar, e depois disso vou lavar com álcool e flambar no bico de bulsen. Depois desse procedimento de lavagem, secagem e limpeza com álcool, vou abrir meu molusco e vou analisar microbiologicamente. 
A diferença para as outras amostras é que vou lavar com água e sabão a casca, utilizar álcool e flambar.
Quando estou trabalhando com amostra de ovo em casca 
O Transporte dessa amostra deve ser feito de maneira com que essa amostra esteja refrigerado. Toda vez que eu transporto minha amostra, essa minha amostra não pode estar em contato direto com o gelo, tem que ter um saco plástico ou alguma coisa evitando esse contato com o gelo.
Quando chega no laboratório, tiro esse ovo da bolsa térmica e coloco na estufa, de forma que o ovo atinja a temperatura de 22ºC. 
Por que colocar o ovo dentro da estufa? quando o ovo atinge a essa temperatura( 22ºC), não ocorre a condensação da casca. Por isso que precisamos colocar na estufa para atingir essa temperatura. 
Depois de atingir 22ºC nessa estufa, vou retirar o ovo da estufa e vou lavar com água e sabão. Um ponto importante é que essa água deve estar numa temperatura em torno de 11ºC acima da temperatura do ovo, por isso que a água deve estar na temperatura de 33ºC. 
Então: transportei meu ovo refrigerado chegou no laboratório coloquei na estufa espero atingir a temperatura de 22ºC após atingir essa temperatura vou lavar com água (33ºC) e sabão, a partir daí vou quebrar o meu ovo e vou analisar a clara e a gema. 
As amostras que são perecíveis, que são mantidas refrigeradas, devem ser analisadas no máximo até o dia seguinte da recepção da amostra, da coleta da amostra. A armazenagem deve ser feita na geladeira com refrigeração.
No caso de produtos congelados, eles devem ser congelados a uma temperatura máxima de (-)18ºC, e tempo até 7 dias para fazer a analise. Então quando recebo produto congelado tenho até 7 dias para fazer a análise.
Alimentos não perecíveis: são aqueles alimentos que já sofreram algum tratamento térmico da industria. Devem ser conservados em local fresco sem a incidência de luz e com pouca umidade . Os não perecíveis (são os enlatados em geral) você pode proceder a análise deles até o dia em que vence a validade, então até ai vc tem o prazo pra analisar. Porém como se trata de uma analise particular, você não vai esperar esse tempo todo, o seu cliente não vai esperar, cada laboratório vai trabalha com um prazo de resultados diferentes dependendo da rotina do laboratório (cada um tem o seu tempo).
Existem outras técnicas diferentes das que falamos semana passada de coleta de material. Quando eu quero coletar material, quando meu objetivo é avaliar a carga microbiana presente numa casca de ovo, eu preciso utilizar uma técnica que é chamada técnica da lavagem superficial.
Técnicas da lavagem superficial
Como é realizada:
Meu objetivo é quantificar a carga microbiana presente na casca do ovo, então eu não preciso trabalhar com a gema e a clara.
Como vou fazer: Pego um saco plástico estéril, vou colocar o meu ovo inteiro ali dentro, e adicionar 200ml de solução salina peptonada(SSP), é uma solução utilizada na regra da diluição que é uma etapa que vamos ver mais a frente, que uma diluição que não estimula nem inibe o crescimento bacteriano ela é neutra, não vai favorecer nem prejudicar o desenvolvimento daquela carga microbiana. Vou pegar o ovo inteiro dentro do saco plástico estéril,vou adicionar 200ml de solução salina peptonada, e vou proceder uma massagem no ovo dentro dessa solução, porque a carga microbiana que tem na casca vai se misturar à solução salina, então a minha amostra vai passar a ser o liquido. Então o que vou analisar nesse caso é o liquido (que é a solução salina peptonada – SSP) que vai estar contaminado com as bactérias, bolores e leveduras que estavam naquela casca. Essa é a técnica da lavagem superficial, porque procedemos uma “lavagem” com solução salina da casca do ovo.
Outra opção de técnica: Técnica de esfregaço de superfície
É uma técnica muito utilizada quando eu quero determinar a quantidade de microrganismos presentes por ex. numa carcaça destinada àa exportação. Porque quando eu tenho uma carcaça destinada a exportação, se eu for realizar a analise microbiológica cortando essa carcaça, eu vou depreciar essa carcaça. Então o que eu faço: para coletar esse material vou utilizar um swab estéril para recolher esse material da carcaça para amostra. 
Como vou fazer para essa análise se tornar representativa: eu vou utilizar moldes estéreis (são pedaços de papel estéril que no meio tem um buraco), coloco esse molde na carcaça, pego meu swab e vou passar no meio do buraco desse molde de papel estéril, faço isso com pelo menos 5 moldes, porque vou colocar esses 5 moldes em cada parte da carcaça para eu obter uma amostra representativa, para cada molde eu utilizo um swab (não repito o mesmo swab em 2 lugares).
	Vantagem desse método: não retiro nenhum pedaço, vou estar apenas recolhendo o material sem alterar visualmente minha carcaça.
Importância de utilizar diversos moldes em pontos diferentes? Porque em cada local eu posso encontrar um tipo de bactéria. Se eu pegar só de um ponto eu não vou ter a representatividade da carcaça inteira. 
Depois que passei os swabs, coloco swab dentro de um frasco com 200ml de SSP. Não preciso fazer um frasco para cada swab, coloco todos os swabs nesse frasco. Minha amostra vai passar a ser de novo os 200ml de solução salina peptonada (SSP).
Essa técnica também pode ser utilizada no chão, bancada, pias, panelas etc. Mas na pratica, ninguém usa o molde pra economizar.
Finalidade dessa técnica: para uma razão exportador, ou seja, para o matadouro exportador, para não perder a carcaça para fazer a análise.
O material que será utilizado no laboratório deve ser preparado. Todo material que for ser usado, deve ser autoclavado, ou material permanente como pipetas, etc. Sempre lembrando que estamos trabalhando com contaminantes, com MO que podem provocar danos a saúde se ocorrer a ingestão daquele MO, então eu preciso descontaminar aquele material que eu utilizei.
As vidrarias são lavadas com uma solução sulfocrômica. Depois que eu lavei essa vidraria com solução sulfocrômica eu vou proceder 8 lavagens em água corrente dessa vidraria, seguido de 2 lavagens com água destilada.
Qualquer laboratório, todo material, a ultima lavagem será sempre feita com água destilada, independente do laboratório. 
Da mesma forma que antes de utilizar eu também posso lavar com água destilada para minimizar a contaminação daquele tecido. A água destilada no laboratório é essencial.
Então espero secar a vidraria e depois vou embalar com o papel amarelo (Papel Kraft = que é aquele papel pardo) e vou enviar o material para esterilização. Essa esterilização que pode ser em auto clave quanto na estufa. 
Diferença: Na autoclave é muito mais rápido do que na estufa. Na estufa leva de 3 a 4 horas para esterilização do material. Enquanto que na auto clave é muito mais rápida, levo 15 minutos dependendo da temperatura. Então na rotina do laboratório é muito mais fácil eu usar a autoclave. 
Geralmente utilizamos a estufa, ou também podemos utilizar o forno de paster (caso o laboratório possua). 
Forno: No caso do forno vou ter a esterilização do meu material. Meu material vai ser submetido a uma temperatura de 170ºC, durante mais ou menos 3 horas. Esse tempo pode variar dependendo do volume de material que eu tenho dentro do meu forno, quanto mais material, maior o tempo pra chegar a temperatura desejada ou não.
Autoclave: uso a temperatura de 121ºC por 15 minutos, ou a temperatura de 120ºC durante 30 minutos.
A autoclave, na rotina do laboratório é mais pratica em termos de tempos do que o forno.
O forno é utilizado mais a parte de vidrarias, pipetas, coisas maiores, etc.
Autoclave é uma panela de pressão grande, onde dentro dela eu tenho uma cesta que vou colocar o meu material dentro. Vou abrir, desafrouxar os parafusos, abrir a tampa e retiro a cesta. Por dentro tem uma marcação que é onde eu vou verificar a quantidade de água que vou colocar. A autoclave deve ter uma quantidade de água dentro dela e essa quantidade de água tem que estar no limite da marcação que existe dentro dela. Essa água deve ser trocada constantemente para não se tornar um foco de contaminação.
Verifico o nível da água se está correto, coloco a cesta com o material dentro. Fecho a tampa, aperto os parafusos para que não exploda. Abro toda a valva e ligo a auto-clave ao máximo, nesse momento minha água ainda está fria, então vou esperar a temperatura da água aumentar, a temperatura vai subir, e vai chegar no momento onde eu deixando a valva aberta, vai começar a sair um vapor, quando o vapor se tornar constante, fluente, eu verifico a temperatura, fecho a válvula, e começo a contar o tempo. Se eu estiver com 121ºC, vou contar 15 minutos. Se eu estiver com 120ºC, vou contar 30 minutos. 
Importante: para manter essa temperatura preciso ter alguém vigiando e além disso vou colocar esse termostato no médio, porque o termostato no médio vai me ajudar a manter a temperatura constante, se eu manter no máximo essa temperatura vai continuar subindo muito mais do que eu quero. Então fechei a válvula, esperei 15 minutos, deu 15 minutos, agora eu abro a válvula para sair o vapor que estava dentro e desligo a auto-clave, nisso espero minha temperatura cair toda, uns 10 minutos até zerar. Abro a válvula, desligo a autoclave, e saio e espero, vejo que o vapor saiu todo (e vejo que zerou a temperatura), ai posso abrir minha autoclave. Só tomar cuidado porque é muito quente, então quanto mais tempo puder deixar esfriando melhor, mais seguro pra você, por conta do vapor. 
Uma coisa importante: Quando você coloca vidros com tampa (ex. vidro de maionese) na autoclave você precisa afrouxar um pouquinho a tampa, pois senão vai quebrar. Tudo que tiver tampa, vc precisa afrouxar um pouco para que a pressão não arrebente.
Para produzir o meio de cultura:
É apenas ler o rótulo, toda embalagem de meio de cultura desidratado vai vir falando como é feito aquele meio. Basicamente precisamos de uma balança que tenha uma precisão considerável pois trabalhamos com gramas, então eu vou pesar aquele meio desidratado de acordo com a recomendação do fabricante e se for necessária a adição de mais ingrediente ao meio, vou pesar.
Ex: No caso da SSP, utilizo o meio chamado de peptona, e para fazer e além disso preciso adicionar cloreto de sódio e isso seria o ingrediente a parte então vou pesar esse ingrediente.
Então pesei o meu meio, os ingredientes necessários, aí vou adicionar uma água que tenha sido destilada recentemente, vou homogeneizar o meio de cultura. Uma vez homogeneizada vou fazer a medição do pH. Essa etapa de aferição do pH é muito importante, porque o pH do meio vai interferir no crescimento microbiano, então eu preciso que o meu meio de cultura esteja com um pH adequado. Esse pH adequado vai variar de meio pra meio e vai estar descrito no rotulo.
Como vou fazer a medição do ph?
Medição do pH: trabalho com uma fita (fita de medir pH de urina), vou pingar umas gotas do meio que preparei.
Se estiver mais ácido do que o recomendado, vou precisar adicionar ao meu meio, uma gotinha de hidróxido de sódio (NaOH) ou de hidróxido de potássio (KOH). 
Se meu pH estiver básico, vou precisar adicionar um ácido, que é o acido tartárico.
Pode acontecer de pingar uma gota de acido e o meu pH acidificar demais,vou ter que pingar uma de básico, vou ajustar até o necessário. Geralmente uma gotinha pequena é suficiente. 
Dependendo do meio vou adicionar corantes e/ou algum tipo de indicador.
Distribuo o meu meio em tubos ou frascos dependendo da minha densidade. 
Uma coisa importante é acondicionar o meio de cultura de forma que a quantidade não seja muito grande dentro do frasco porque na minha análise eu posso não utilizar tudo de uma vez e seu abrir essa frasco vai contaminar.
Ex. fiz 2L de cultura, é melhor dividir em frascos de 500ml, pois um dia posso usar um frasco e outro dia outro frasco, e assim vou evitando o desperdício. 
Além disso quando trabalho com meio sólido que no caso é o Agar, preciso que esse meio esteja no estado líquido, então eu tenho que colocar o meu meio de cultura em banho Maria, e se eu tiver uma quantidade muito grande dentro do meu recipiente vai demorar horas para conseguir o meio líquido e isso atrapalha a rotina do laboratório. 
A melhor forma é distribuir em quantidades menores, como 400ml por frasco para facilitar a rotina do laboratório. 
O meio de cultura, se você coloca na autoclave (alguns meios vc precisa autoclavar), acontece a mesma coisa, você precisa afrouxar um pouco a tampa antes de colocar na autoclave para que não exploda. No momento que eu tiro da autoclave eu imediatamente fecho para que não haja contaminação. 
Microrganismos indicadores nos alimentos:
Essa análise geralmente é realizada em produtos que estão sendo submetidos a análise microbiológica e não estão envolvidos em um surto. São analises de rotina.
Esses MO indicadores são grupos ou espécies que vão funcionar como um indicador. Essa contagem desse grupo pode indicar a ocorrência de uma contaminação fecal no alimento, a possível presença de um patógeno, ou uma condição sanitária inadequada durante o processamento, armazenamento ou o transporte. Dá indicação de deterioração do alimento, etc. Eles vão indicar uma situação, uma falha no processamento ou no transporte ou no armazenamento do alimento.
Como principais grupos de MO indicadores, temos os MO indicadores:
- Aeróbios Mesófilos; 
- Psicotróficos ;
- Bolores e Leveduras
Ex. Os aeróbios mesófilos é um grupo extenso, posso ter: coliformes posso ter salmonella, posso ter inúmeros microrganismos. Não vou conseguir fazer a identificação, eu vou saber que naquele produto tem uma contagem elevada desse grupo, por isso que eu não faço em produtos envolvidos em algum surto porque no surto eu vou precisar saber exatamente qual foi o MO envolvido.
Para o MO ser considerado indicador ele precisa atender alguns requisitos: 
Ele deve ser de:
- Rápida e fácil detecção 
- Facilmente distinguível de outros MO que possam crescer naquele alimento.
- Não pode ser contaminante natural do alimento 
- Deve estar presente quando o patógeno associado estiver. Ex: se eu tenho uma contaminação por coliformes fecais eu preciso ter uma contagem de aeróbios mesófilos mais elevada, porque: os coliformes fecais são aeróbios mesófilos, então quando eu tenho um patógeno presente para ser indicador o meu grupo de MO deve estar presente também quando aquele patógeno estiver.
- Devem estar ausente nos alimentos que não possuírem esse patógeno porque se meu alimento tiver a presença desse MO indicador no momento que eu não tenho patógeno ele não vai ser mais indicador daquele patógeno ele vai ser apenas um mero coadjuvante. 
Esses MO indicadores não atendem a todos os requisitos, mas por ex: bolores e leveduras não é rápida a detecção demora um pouco a análise, mais eles são considerados indicadores.
Os aeróbios mesofilos
São um grupo de MO indicadores que nos dão a melhor indicação quanto a qualidade daquele alimento. Porque esse grupo possui como temperatura ótima de crescimento a temperatura ambiente. 
Como a temperatura ótima de crescimento é a ambiente, esse grupo vai ser um grande problema nos nossos alimentos (quando eu tenho um alimento fora da geladeira até a hora do almoço esse grupo vai estar crescendo), com isso eles são um grupo que vão dar boa indicação sobre a qualidade do meu alimento. Além de possuir a temperatura ótima ambiente, eles possuem também um crescimento em uma ampla faixa de temperatura, então mesmo que não esteja em temperatura ambiente, eles vão estar crescendo também. Então por eles crescerem em uma ampla faixa de temperatura e ter uma temperatura ótima de crescimento a temperatura ambiente, eles vão funcionar como uma indicação da sanidade daquele alimento.
Também vai nos ajudar a ver o grau de higiene existente naquele alimento. 
Aplicação disso: 
Quando eu faço a contagem de aeróbios mesófilos em alimentos perecíveis, e essa contagem der elevada de aeróbios mesófilos é porque a cadeia de frio não está sendo mantida, porque os alimentos perecíveis devem ser mantidos em refrigeração se eu tenho uma contagem elevada de aeróbios mesófilos significa que aquela cadeia de frio ela não foi mantida porque eles crescem melhor em temperatura ambiente. 
Então se tratando de alimentos perecíveis, quando tenho a contagem de aeróbios mesófilos elevada eu vou pressupor que a cadeia de frio não está sendo mantida, ou estão desligando a geladeira a noite, ou está ocorrendo oscilações de temperaturas, alguma coisa quanto a isso está acontecendo.
Alimentos não perecíveis: 
Quando a contagem de aeróbios mesofilos for elevada, significa que esse alimento passou por um tratamento térmico inadequado. Porque: quando tenho um produto não perecível, esse produto pode ser mantido em temperatura ambiente, mas para manter em temperatura ambiente e que não estrague, ele foi submetido a um processamento térmico (ex: leite UHT, conservas) a uma esterilização comercial, e esses processos visam destruir os MO presentes. Se estiver contagem de MO elevado nos meus alimentos não perecíveis, significa que o meu tratamento térmico não foi suficiente para destruir a carga microbiana então eu vou ter uma alta contagem. Então meu alimento passou pelo tratamento térmico de forma inadequado. 
Psicotróficos: 
Esses MO serão pesquisados em alimentos que serão conservados pelo frio, ou seja, alimentos refrigerados. Porque apesar de crescer bem em temperatura ótima ambiente, eles possuem a capacidade de se multiplicar na temperatura de 4-7ºC, que é a temperatura de refrigeração. Então vou fazer a contagem de MO psicotróficos em alimentos refrigerados. 
A maioria dos MO psicotróficos são deteriorantes. Então quando eu tenho uma alta contagem de psicotróficos no alimento, ele vai refletir no prazo de validade. 
Quanto maior for a contagem desses MO psicotróficos, menor vai ser o prazo de validade do meu alimento. 
Os psicotróficos vão nos dar uma indicação de vida útil para aquele alimento refrigerado. 
Os psicotróficos são deteriorantes porque tem capacidade de produzir enzimas proteolíticas e lipolíticas, e essas enzimas são responsáveis pela putrefação, deterioração daquele alimento. 
Os psicotróficos são muito encontrados em: água, leite refrigerado, são um grupo sempre presentes.
Quanto aos bolores e leveduras:
São mais resistentes a baixa oferta de água de atividade e ao pH ácido do que as bactérias, ou seja, eles crescem bem em alimentos que sejam secos ou ácidos, porque eles são mais resistentes à baixa água de atividade e ao pH ácido (quando comparado as bactérias). 
Geralmente vou pesquisar um alimento que seja seco ou/e ácidos.
São de difícil identificação porque você precisa esperar muito tempo até que tenha um crescimento. Geralmente quando tem alta contagem de bolores e leveduras no meu alimento, os riscos de ter micotoxina no meu alimento é bem alto. 
	Quando tenho alta contagem de bolores e leveduras eu tenho um alto risco de ter uma micotoxina no meu alimento.
Para fazer a contagem dos MO em placas. Existem 2 métodos em placa:
- Plaqueamento em profundidade (Pour Plate) e; 
- Superfície também conhecido como (Spread plate).
Os métodos de contagem em placas vão permitir que nós façamos a identificação e a contagem de grandes grupos como: os indicadores, oude uma espécie especifica.
Os meios de cultura que serão utilizados vão variar de acordo com a minha finalidade. E também as condições de incubação, que seriam: tempo e temperatura, que também são variáveis dependendo do MO que estou pesquisando.
Os métodos de contagem em placas, vão me dar resultado em unidades formadoras de colônias (UFC). UFC/g ou UFC/ml (ml é quando trabalho com uma amostra liquida).
Para realizar contagem de MO nas placas eu preciso ter colônias isoladas. Se eu tiver uma placa onde as colônias que cresceram, não cresceram de forma isolada, eu não vou conseguir fazer a contagem, por isso que a homogeneização da minha amostra também é importante.
Para que eu obtenha colônias isoladas, vou precisar realizar a:
Diluição e homogeneização. Essa é a primeira etapa que vai ocorrer depois que eu abrir a minha amostra no laboratório (dentro da minha câmara de fluxo laminar).
Objetivo da etapa de diluição e de homogeneização: é de obter colônias isoladas permitindo a contagem em placas. Se eu não diluir a minha amostra e nem homogeneizar, eu vou ter uma placa cheia de colônias inviáveis de contar.
Se a amostra não for diluída eu não consigo contar, então eu tenho que diluir a minha amostra pra obter as colônias isoladas. Então é de fundamental importância a diluição para que seja realizada a contagem das UFC. 
Geralmente vou trabalhar de 3 a 5 diluições, sendo que isso pode variar dependendo do meu produto. Na rotina no laboratório não passa de 5 pois dá muito trabalho. 
Mas em casos de mestrados, trabalhos, geralmente diluímos mais. 
Ás vezes não sabemos qual a diluição que devemos utilizar, mas na pratica onde o alimento não tem uma carga microbiana tão elevada, até 5 diluições são suficientes. Até mesmo porque no dia a dia do laboratório não dá pra fazer 30 diluições de uma amostra, é inviável. Então quando se trabalha com produto in natura (porque a carga microbiana é maior do que o produto processado) geralmente faz mais diluições do que o produto processado, porque o produto in natura não sofreu nenhum tratamento térmico (ex. carne).
Diluir a amostra:
Para diluir eu preciso ter um diluente, que é a SSP (solução salina peptonada). Essa é a solução mais usada no laboratório de microbiologia. 
Quantidade de SSP pra diluir a minha amostra: vou utilizar 9x a quantidade do peso da minha amostra. 
Ex. Se tenho uma amostra de 10 g, vou usar 90ml de SSP. (como a quantidade diluente é nove vezes a quantidade da amostra, vou usar nesse caso 10 x 9 = 90, vou usar 90 ml de SSP). 
Uma coisa importante: quando estou trabalhando com amostras sólidas ou semi sólidas eu preciso triturar, homogeneizar melhor essa amostra. 
O que vou fazer: eu vou colocar a minha amostra na quantidade adequada de solução salina (nesse caso 90 ml) e vou pegar a amostra e vou virar num saco plástico estéril. Esse saco plástico estéril será colocado dentro de um aparelho chamado Stomacher. 
O stomacher tem como finalidade distribuir uniformemente a carga microbiana. Em menos de 1 minuto o alimento já está pronto e triturado, retiro o saco dali, lembrando que esse saco tem que estar fechado pois vou estar trabalhando fora da minha área de segurança (que é o bico de bursen ou capela), e se tiver aberto vai ter contaminação. Depois da homogeinização no stomacher eu vou colocar minha amostra de volta ...
Quando se trata de uma amostra liquida você não precisa usar o stomacher, na própria mão você homogeneíza, pode sacudir.
A homogeneização é de fundamental importância para que a carga microbiana esteja distribuída uniformemente na minha amostra.
Como vai ser feita essa diluição:
Suponho que minha amostra seja de 10g de carne. 
Vou colocar minha amostra de 10g dentro de um recipiente com 90ml de SSP. (nesse caso é 90ml porque a quantidade de diluente é 9x a quantidade de amostra). Nesse momento eu já tenho a minha primeira diluição, nesse momento vou ter 0,1 da carga microbiana inicial presente nessa diluição porque quando eu diluo, eu diminuo a minha carga microbiana, então nesse momento, é a diluição que chamo de 10-1 :
Como chego nesse 10-1 ? Faço uma conta.
Onde, colocamos no numerador a quantidade da amostra, peso, e o denominador vou somar a quantidade de SSP existente e o peso da amostra.
 10 = 0,1 ou seja, 10-1 
90 + 10
Nesse momento, a minha carga microbiana vai ser 10-1 a partir da carga microbiana inicial da minha amostra, eu dilui uma vez.
2ª Diluição: pego 1ml da minha 1ª diluição anterior, vou colocar dentro de um tubo com 9ml SSP (são 9ml porque a quantidade de solução salina é 9x a quantidade de amostra que estou colocando aqui dentro, ou seja, usei 1 ml da amostra x 9 = 9ml de SSP).
Para chegar ao meu resultado: vou utilizar no meu numerador 10-1 que é o valor da diluição anterior, e no denominador eu uso a quantidade de salina (diluente adicionado) mais a quantidade de amostra adicionada
 0,1 = 0,01 = 10-2
 9 + 1
vou ter 0,01 da carga microbiana inicial, essa vai ser a diluição de 10-2 (resultado da minha 2ª diluição).
3ª Diluição: pego outro tubo, coloco 1ml da minha 2ª diluição (10-2), dentro de um tubo contendo 9ml de SSP, porque a minha quantidade é 1ml e eu preciso de 9x a quantidade da amostra.
 0,01 = 0,001 = 10-3
 9 + 1
Uso o numerador da diluição anterior sobre a quantidade de diluente mais a quantidade de amostra, onde vou ter como resultado da 3ª diluição: 0,001 ou 10-3
Se eu quisesse fazer uma 4ª diluição eu pegaria 1ml + 9ml de SSP, e assim por diante até chegar no numero de diluições que eu quero.
Importante é prestar atenção no peso da amostra porque vai ser o determinante da quantidade de salina que você vai utilizar. Se eu tenho uma amostra que pese 20g eu vou precisar de 180ml de solução salina para minha diluição. 
Os valores de diluição vão ser o mesmo, independente se minha amostra for de 27, 100 ou mil g. A diluição vai ser sempre 1:10, 1:100, 1:1000.
Ex. Esquematize uma diluição para uma amostra de 30g, vocês vão fazer a mesma coisa. Esses resultados aqui sempre vão ser os mesmos, o que vai mudar é a quantidade de salina que eu estou colocando. Se eu trabalhar com uma amostra pesada, leve, vai variar.
A diluição é uma etapa fundamental para que tenhamos colônias isoladas, pra conseguir fazer essa contagem.