determinação do teor de proteínas

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INTRODUÇÃO 
 Proteínas são macronutrientes constituídos por uma cadeia de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Possuem funções estruturais, de transporte, hormonal, de armazenamento e defesa. Diferenciam-se quimicamente das outras frações de nutrientes que constituem um alimento por possuírem um átomo de nitrogênio em sua composição (COULTATE, 2004).
 A partir desta particularidade, pode-se determinar a quantidade de proteínas presentes nos alimentos. O método mais utilizado é pelo processo de digestão Kjeldahl, proposto em 1883 pelo mentor de mesmo nome. Este processo é constituído de três etapas, digestão, destilação e titulação. A proteína sofre uma hidrólise ácida e, assim a matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio transformado em amônia. Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o fator empírico 6,25 para transformar o número de g de nitrogênio encontrado em número de g de proteínas (COULTATE,2004).
 As proteínas são compostas de aminoácidos e têm a função de reparar os tecidos, participam no equilíbrio entre os fluidos do corpo, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais. São encontradas nas carnes vermelhas, frango, peixe, ovos, leite e derivados. Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades organolépticas e de textura. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos (CECCHI, 2003).
 Vários métodos podem ser empregados para a análise das proteínas, dentre esses métodos podemos citar os métodos de Kjeldahl e Formol. O método de Kjeldahl determina N orgânico total, isto é, o N proteico e não proteico orgânico. Porém, na maioria dos alimentos, o N não proteico representa muito pouco no total. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores (CECCHI, 2003).
 Métodos baseados no teor de nitrogênio: Nitrogênio é o elemento de propriedades mais distintas presente nas proteínas. O teor em materiais biológicos não provém somente das proteínas, mas também de outros componentes como ácidos nucleicos, aminas carboidratos e lipídios substituídos por radicais nitrogenados, aminoácidos não proteicos etc. A medida de nitrogênio é uma boa estimativa do conteúdo de proteínas de materiais biológicos. A análise de nitrogênio total é o método mais usado para diferenciar carboidratos e lipídeos de proteínas (JOSÉ CARLOS E GUSTAVO, 2011).
 O método consiste em aquecer inicialmente a mostra contendo nitrogênio com excesso de ácido sulfúrico concentrado até que todo carbono seja oxidado a CO2. Modificações posteriores usam da adição de catalisadores, para acelerar a oxidação. Após a digestão, basifica-se com hidróxido de sódio para destilação da amônia (NH3) formada (JOSÉ CARLOS E GUSTAVO, 2011). Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCL) padronizada (CECCHI, 2003).
 O método do formol e muito aplicado para proteínas do leite e, dentro de certos limites, rende boas correlações entre proteína por Kjeldahl e proteínas por titulação após reação com formol. Essencialmente, o método é baseado no princípio de que, na região de pH 8,3, grupos amino livres das proteínas (-NH2 terminal, –NH2 da lisina e, até certo ponto, arginina) reagem com aldeído fórmico formando compostos amínicos e com consequente liberação de prótons. Esse método é altamente correlacionado com o teor de proteína. O princípio do método consiste na reação do formaldeído com os grupos –NH2 das proteínas, deslocando o equilíbrio químico no sentido da liberação de prótons, que estavam anteriormente ligados a esses grupos formando os grupos –NH3+. Ao reagir com os grupos –NH2, o formaldeído desloca o equilíbrio químico para manter a constante que governa tal equilíbrio. Os prótons liberados são neutralizados (titulados) com uma solução de hidróxido de sódio, formando uma correlação entre quantidade de proteína e quantidade de hidróxido de sódio gasta para neutralizá-los (JOSÉ CARLOS E GUSTAVO, 2011).
 O objetivo da prática foi conhecer as etapas do método de digestão de Kjeldahl, para determinar a concentração de proteínas na amostra. Analisar as etapas de digestão, destilação e titulação da amostra, analisando detalhadamente cada uma a fim de compreender os processos a que a amostra foi submetida e como estes interferem na determinação da concentração proteica.
METODOLOGIA
 A prática foi realizada no Laboratório de Bromatologia e Bioquímica dos Alimentos da UFPI e foi realizada pelos alunos com o auxílio da professora Karolline e da doutoranda Izabel.
 Os materiais utilizados para essa prática foram: Bloco digestor de proteínas, Balança analítica, Balança semi - analítica, Aparelho de Kjeldhal, Tubo de digestão de proteínas, Pipetas, Pêra, Erlenmeyer, Agitador magnético, Vortex, Destilador, Papel manteiga, Gelo, Amostra dessecada de farinha de trigo e como indicadores foram utilizados: Ácido sulfúrico, Sulfato de cobre, Sulfato de potássio, Ácido concentrado (HCl), Hidróxido de sódio, Ácido bórico, indicador de Kjeldhal e Vermelho de metila.
 Os procedimentos foram realizados em duas etapas:
I etapa: Pesou-se 50 mg de amostra dessecada em papel manteiga e transferiu-se para os tubos de digestão (A, B, C, D). Adicionou-se os seguintes reagentes no tubo de digestão: 40 mg de sulfato de cobre, 2g de sulfato de potássio e 3 mL de ácido sulfúrico concentrado (adicionado na capela de exaustão). Colocou-se os tubos no bloco digestor a 450ºC até que a solução passasse de preto para esverdeada.
 Para essa prática foi necessário o preparo de 350mL de hidróxido de sódio (NaOH 40%) que teve os seguintes processos: Pesou-se 140g de hidróxido de sódio, colocou-se em um balão volumétrico com água destilada, levou-se ao agitador magnético até a solução ficar totalmente homogeneizada.
II etapa: Depois de digerido acrescentar 10 mL de água e levar ao vortex até ficar totalmente límpido, sem qualquer parte precipitada. Enquanto esse procedimento era realizado foi colocado nos erlenmeyer’s 5mL de ácido bórico, 2 gotas do indicador de Kjeldhal e 2 gotas de vermelho de metila. Depois pegou-se a amostra digerida e colocou-se em cada erlenmeyer (A, B, C, D) de acordo com os respectivos tubos. No funil do destilador colocou-se 100mL de NaOH, sendo 25mL para cada tubo com a amostra. A solução foi transferida para o tubo do destilador e foi colocado um erlenmeyer de cada vez contendo a amostra até que atingisse um volume de 50mL para ser levado para titulação. Depois de atingido o volume foram levados para titular e adicionou-se HCl até o ponto de viragem.
 O tubo D foi o que é denominado “o branco”, portanto foi adicionado só os reagentes no tubo digestão conforme indicado no roteiro da prática.
 Para a titulação utilizou-se o ácido clorídrico (HCL 0,02 N) até o ponto de viragem de cada amostra, sendo:
 4 mL no tubo 1A 
 3,7 mL no tubo 1B
 3,7 mL no tubo 1C
 0,5 mL no tubo 1D ( branco)
 Assim finalizando todo os procedimentos.
REFERÊNCIAS 
ANDRADE, Edira Castello Branco; Análise de alimentos uma visão química da nutrição, 2ª edição, Varela, São Paulo, 2009, pg 62-65.
Avaliação da Qualidade Tecnológica/Industrial da Farinha de Trigo, disponível em http://www.ufrgs.br/napead/repositorio/objetos/avaliacao-farinha-trigo/1d.php acesso em 01/07/2016
CECCHI, Heloisa Mascia; Fundamentos teóricos e práticos da análise de alimentos, 2ª edição, UNICAMP, Campinas, 2003, pg 61-64.
COULTATE, T.P.; Alimentos a química de seus componentes, 3ª edição, Artmed, Porto Alegre, 2004, pg 113-116.
GOMES, José Carlos; OLIVEIRA, Gustavo Fonseca; AnálisesFísico-químicas de Alimentos. Editora UFV, 2011.
MAHAN, L. Kathleen; Krause, Alimentos, Nutrição e Dietoterapia, 11[ edição, Roca, São Paulo, 2005.
TACO - Tabela brasileira de composição de alimentos / NEPA – UNICAMP.- 4. ed. rev. e ampl.. -- Campinas: NEPA- UNICAMP, 2011.
ZENEBON, Odair, PASCUET; Neus Sadocco; TIGELA, Paulo; Métodos físico-químicos para analise de alimentos, 4ª edição, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2008, pg 122-124.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1: Teor de Proteínas na farinha de trigo dessecada
	Amostras
	Teor de Proteínas (%)
	1A
	10,26
	1B
	9,7
	1C
	9,7
Fonte: Laboratório de Bromatologia e Bioquímica dos Alimentos, UFPI.
 A qualidade nutricional de uma proteína pode ser medida através do conhecimento da sua concentração nos alimentos e da sua composição de aminoácidos. Para a determinação dos aminoácidos em um alimento, são utilizadas técnicas cromatográficas. O método mais utilizado para a determinação da concentração de proteica é o de Kjeldahl, que parte do conceito de que a fração de nitrogênio não-proteico de um alimento é irrelevante e, na determinação de nitrogênio total obtém-se o conteúdo de proteínas. (COULTATE, 2004).
 A proporção de nitrogênio para a maioria das proteínas é de 16% do peso total, ou seja, em 100 g de proteínas, 16 g corresponde a nitrogênio. Assim, um fator de 6.25, que é a diferença entre o peso total e o peso correspondente ao nitrogênio, é utilizado para converter o teor deste em concentração de proteínas. Em alguns alimentos, como cereais, que têm variações na concentração de aminoácidos, um fator diferenciado é utilizado para obter-se maior precisão. (COULTATE, 2004; ZENEBON et al, 2008).
 No método referido, primeiramente a amostra protéica passa por uma hidrolise ácida, com ácido sulfúrico concentrado, na presença de calor e de uma mistura catalisadora que acelera a reação. Sendo a proteína formada por cadeias de aminoácidos unidos por ligações peptídicas que, segundo Mahan (2005), “é formada entre o grupo carboxila do primeiro aminoácido e o nitrogênio do segundo’’, o ácido hidrolisa os grupamentos amina.
 A mistura catalisadora, utilizada na hidrólise ácida, é composta de substancias que aumentam a velocidade da reação, fornecendo um mecanismo de reação diferente entre reagentes e produtos. Os catalisadores mais utilizados são mercúrio, cobre e selênio, geralmente é utilizada uma mistura, pois, em pequenas concentrações evita-se os problemas de toxidez e perda de nitrogênio causada por estes. (ANDRADE, 2009; CECCHI, 2003).
 Após permanecer no bloco digestor por algum tempo, a amostra torna-se transparente, o que indica que esta totalmente digerida e, transformada em sulfato de amônia. Esta amostra passa pelo processo de destilação, no tubo micro-kjeldahl é adicionado água e hidróxido de sódio (NaOH) 40% para alcalinizar a amostra, esta é destilada pelo aparelho. A amônia desprendida é recolhida em um erlenmyer com ácido bórico, que fixa a amônia formando o borato de amônia de coloração azul. (CECCHI, 2003).
Tabela 2: Média e Desvio Padrão do teor de Proteínas na farinha de trigo dessecada
	Média
	Desvio Padrão
	9,9%
	0,32
Fonte: Laboratório de Bromatologia e Bioquímica dos Alimentos, UFPI.
 As proteínas da farinha de trigo podem ser avaliadas de duas maneiras: qualitativamente e quantitativamente. A avaliação quantitativa de proteínas pode ser feita por vários métodos, sendo o método padrão de Macro Kjeldahl e o NIR os mais utilizados (UFRGS). 
 A percentagem de proteínas presentes em uma amostra de farinha é obtida pelo método padrão de Macro Kjeldahl, através da determinação do conteúdo de nitrogênio da amostra e da multiplicação deste valor por um fator específico (5,75 para trigo e derivados e 6,25 para outros produtos). Através deste método pode-se determinar a quantidade de todas as proteínas presentes, sejam elas solúveis (albuminas e globulinas) ou insolúveis (gliadina e glutenina) (UFRGS).
 Para a panificação e outros segmentos que utilizam a farinha de trigo como matéria-prima, prefere-se a determinação do teor de glúten (formado após adição de água na massa, correspondendo à porção insolúvel das proteínas) ao teor de proteína, para que se possa determinar a qualidade funcional da farinha. Existe uma correlação entre o conteúdo de proteínas e o de glúten em trigo, sendo, normalmente o primeiro 17 a 18% maior do que o segundo (glúten seco x 1,18 ≈ proteínas). Segundo a legislação brasileira (Portaria 354/96) as farinhas de trigo integral, comum e especial devem ter um mínimo de 7,0 % de proteína (N x 5,75). No entanto, para os produtos oriundos de trigo Durum, estes valores são maiores, 10,5% para a sêmola e semolina, 11,0% para a farinha de trigo e 11,5% para a farinha integral de trigo (UFRGS).
 Segundo a tabela TACO o teor de proteínas na farinha de trigo deve ser de 9,8 g/100g.
 Com base na análise dos cálculos feitos podemos observar que a amostra analisada se encontra de acordo com os padrões encontrados na literatura.
CONCLUSÂO
 Diante de todo os procedimentos da prática podemos observar a importância da determinação do teor de proteínas em um determinado alimento, pois a determinação influenciará na forma de uso do mesmo. Alisando os cálculos feitos podemos afirmar que a amostra de farinha de trigo dessecada está dentro dos padrões do teor de proteínas indicados pela legislação.
APÊNDICE
Tabela 3: Medidas em miligramas do material utilizado
	Amostras
	Amostra
	Sulfato de cobre
	Sulfato de potássio
	1A
	55 mg
	40 mg
	2000 mg
	1B
	53,3 mg
	40 mg
	2000 mg
	1C
	53 mg
	40 mg
	2000 mg
Fonte: Laboratório de Bromatologia e Bioquímica dos Alimentos, UFPI.
Determinação de Nitrogênio e do Teor de Proteínas da amostra de Farinha de Trigo dessecada
Fórmula para cálculo da determinação de Nitrogênio
%N= (mL HCL-x mL branco) x 0,02 x 14,007 x 100 x Fator de correção do ácido
Mg de amostra
 Cálculo para amostra 01 Cálculo para amostra 02
%N1A = =1,76% %N1B= = 1,66%
Cálculo para amostra 03 
%N1C= = 1,66%
Cálculo para determinação do teor de proteínas
Amostra 1A 
%PROT=1,76 x 5,83= 10,26% ou 10,26g/100g
Amostra 1B 
%PROT=1,66 x 5,83= 9,7% ou 9,7g/100g
Amostra 1C 
%PROT=1,66 x 5,83= 9,7% ou 9,7g/100g
Cálculo da Média e Desvio Padrão
 = 
= 
= 9,9% 
Imagens dos procedimentos da prática
Etapa I
Imagem 1: Pesagem da amostra da farinha de trigo dessecada
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 2: Adição do ácido sulfúrico nos tubos com a amostra
Fonte: Arquivo Pessoal
 
Imagem 3: Tubos durante e depois da digestão, respectivamente
Fonte: Arquivo Pessoal
Preparação do Hidróxido de Sódio
Imagem 4: NaOH e água destilada sendo colocado no béquer 
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 5: Solução já homogeneizada no agitador magnético
Fonte: Arquivo Pessoal
Etapa II
Imagem 6: Tubo de digestão no vortex 
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 7: Adição dos indicadores no erlenmeyer
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 8: Erlenmeyer no destilador
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 9: Titulação das amostras com HCL
Fonte: Arquivo Pessoal
Imagem 10: Amostras tituladas nos seus devidos pontos de viragem
Fonte: Arquivo Pessoal
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO
DISCIPLINA: BROMATOLOGIA
ANA PAULA DA SILVA ANDRADE SANTOS
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNASTERESINA-PI, 05 DE JULHO DE 2016
ANA PAULA DA SILVA ANDRADE SANTOS
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS
PROFESSORA: DRA. KAROLINE DE MACÊDO GONÇALVES FROTA
TERESINA-PI, 05 DE JULHO DE 2016